用于差分檢測的嵌入染料的制作方法
【專利說明】用于差分檢測的嵌入染料
[0001 ]相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求于2014年I月10日提交的美國臨時申請61/926，172號的優先權，該文的全部內容通過引用納入本文用于所有目的。
【背景技術】
[0003]可檢測或定量核酸以搜索有用的基因、診斷疾病或鑒定生物體。設計為檢測或定量核酸的分子方法可用于檢測突變、檢測稀有核酸、定量基因表達、測量RNA穩定性等。這類分子方法可用于確定核酸的相對比例。例如，分子方法可用于確定與樣品中野生型核酸的豐度相比突變或多態性核酸的豐度。
[0004]用于檢測或定量核酸的方法和組合物包括數字方法，其中樣品被分為多個混合物劃分產物并確定各劃分產物中是否存在一種或多種感興趣的核酸。在一些情況中，兩種或多種檢測試劑或探針被用于檢測劃分產物中兩種或多種感興趣的核酸。在這類情況中，探針或其他檢測試劑的交叉反應性可使得難以明確地檢測或定量感興趣的核酸。例如，當一種感興趣的核酸比另一種更普遍時，例如當一種核酸代表野生型序列且另一種代表突變時，檢測試劑的交叉反應性可造成特別的困難。當一種感興趣的核酸與另一種非常類似時，交叉反應性也可造成特別的困難。
【發明內容】
[0005]在一些實施方式中，本發明提供一種核酸序列檢測方法，包括:提供包含DNA或RNA核酸的樣品；將所述樣品劃分為一組混合物劃分產物;使用序列特異性檢測試劑檢測劃分產物中是否存在靶核酸；以及使用非特異性檢測試劑檢測劃分產物中是否存在雙鏈核酸，從而檢測劃分產物中靶核酸與總核酸的比率。
[0006]在一些方面中，在檢測前擴增核酸。在一些情況中，該非特異性檢測試劑是標記的核苷三磷酸，且檢測是否存在雙鏈核酸的步驟包括在擴增后洗去未摻入的標記的核苷三磷酸。例如，該非特異性檢測試劑是在擴增步驟期間摻入至一個或多個結構上不同的擴增子中的標記的核苷三磷酸，且檢測是否存在雙鏈核酸的步驟包括在擴增后洗去未摻入的標記的核苷三磷酸，并檢測一個或多個結構上不同的擴增子中摻入的標記物。
[0007]在一些方面中，該非特異性檢測試劑是嵌入染料。例如，該嵌入染料可選自:EvaGreen、picogreen、溴化乙啶、SYBR Green KSYBR Go Id、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO 和BEBO。在一些方面中，該序列特異性檢測試劑選自結構化探針(structured probe)和線性探針。在一些情況中，該結構化探針選自分子信標和蝎型探針(scorp1n probe)。在一些情況中，該線性探針選自雜交探針和水解探針。
[0008]在一些方面中，該非特異性檢測試劑是檢測總雙鏈核酸的引物(或引物的混合物，如隨機引物的混合物)。
[0009]在前述實施方式、方面或情況的任一種的一個方面中，該核酸是RNA，且該方法還包括逆轉錄該RNA核酸。
[0010]在前述實施方式、方面或情況的任一種的一個方面中，該方法包括擴增兩種或多種潛在的擴增子。在一些方面中，在存在雙鏈核酸的混合物劃分產物中，潛在的擴增子之一的量為小于50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更少。在一些情況中，該序列特異性檢測試劑檢測一種特異性擴增子，且該非序列特異性檢測試劑檢測任何擴增子。
[0011]在前述實施方式、方面或情況的任一種的一個方面中，該序列特異性檢測試劑檢測序列變體。在一些情況中，該序列變體是稀有序列變體。在一些情況中，雙鏈核酸存在于多個混合物劃分產物中，且該稀有序列變體存在于小于約50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更少的混合物劃分產物中。
[0012]在前述實施方式、方面或情況的任一種的一個方面中，該方法包括通過對混合物劃分產物數目進行計數來確定總核酸濃度，所述混合物劃分產物中非特異性檢測試劑檢測到核酸或檢測到擴增的核酸。在一些情況中，該方法還包括通過對混合物劃分產物數目進行計數來確定靶核酸序列濃度，所述混合物劃分產物中序列特異性檢測試劑檢測到核酸或檢測到擴增的核酸。在一些情況中，該方法還包括確定其中序列特異性檢測試劑檢測到核酸(如擴增的核酸)的混合物劃分產物與其中非序列特異性檢測試劑檢測到核酸(如擴增的核酸)的混合物劃分產物的比率，該比率表示樣品中包含靶核酸的核酸比例。在一些情況中，該方法還包括報告該比率。
[0013]在一個實施方式中，本發明提供一種核酸序列檢測方法，包括:提供包含DNA或RNA核酸的樣品，該D NA或RNA核酸包含第一革E標和第二革E標;將所述樣品劃分為一組混合物劃分產物；以及使用結合第一靶標(如果存在)的特異性檢測試劑(如特異性檢測第一靶標而非第二靶標)和結合并從而檢測兩種靶標(如果存在)的非特異性檢測試劑來檢測至少一個混合物劃分產物中的第一靶標和第二靶標;從而確定樣品中第一靶標的濃度以及第一和第二靶標的濃度。
[0014]在一個方面中，該方法還包括在混合物劃分產物中擴增這些靶標;檢測包括檢測第一和第二靶標的擴增;且該特異性檢測試劑結合代表第一靶標的擴增子(例如特異性結合并從而檢測第一靶標而非第二靶標的擴增子)且該非特異性檢測試劑結合并從而檢測代表第一和/或第二靶標的擴增子。
[0015]在一個方面中，該檢測包括在至少一個混合物劃分產物中確定是否存在第一靶標且確定是否存在第一或第二靶標。在一些情況中，對多種混合物劃分產物進行檢測。在一些情況中，該方法還包括確定包含第一靶標的混合物劃分產物與包含第一或第二靶標的混合物劃分產物的比率。在一些情況中，該方法還包括報告該比率。
[0016]在一個方面中，該第一靶標是突變體或多態性且該第二靶標是野生型核苷酸序列。
[0017]在一個實施方式中，本發明提供了一種包含少于約10nL的混合物劃分產物的組合物，其包含:包含DNA或RNA的核酸;非特異性檢測試劑;和序列特異性檢測試劑。在一個方面中，該組合物還包含擴增試劑。在一個方面中，該非特異性檢測試劑選自:EvaGreen、溴化乙啶、SYBR Green KSYBR Gold、Yo-Yo、Yo-Pro、T0T0、B0XT0和ΒΕΒ0。該非特異性檢測試劑可以是檢測總雙鏈核酸的引物。該非特異性檢測試劑可以是標記的核苷三磷酸。該序列特異性檢測試劑可選自分子信標、蝎型探針、雜交探針和水解探針。
[0018]在一個實施方式中，本發明提供了一組混合物劃分產物，其中，多個混合物劃分產物包含前述組合物之一。在一些情況中，該組包含至少約100、200、500或1000個混合物劃分產物。在一些情況中，多個混合物劃分產物包含雙鏈核酸。在一些情況中，大多數包含雙鏈核酸的混合物劃分產物不包含靶核酸。在一些情況中，該靶核酸是序列變體。
[0019]附圖簡要說明
[0020]圖1:描述了通過使用兩種序列特異性探針的數字液滴PCR檢測含有DNA分子群體的樣品中稀有SNP的典型實驗。其中未檢測到野生型或稀有變體的液滴表示為“一”且歸類在左下象限。其中僅檢測到野生型核酸的液滴表示為且歸類在右下象限。其中檢測到野生型和稀有變體的液滴表示為“++”且歸類在右上象限。其中僅檢測到稀有變體的液滴表不為“_+”且歸類在左上象限。
[0021]圖2:描述了通過使用一種序列特異性探針和一種非特異性探針的數字液滴PCR檢測含有DNA分子群體的樣品中稀有SNP的實驗。其中未檢測到野生型或稀有變體的液滴表示為且歸類在左下象限。其中僅檢測到野生型核酸的液滴表示為且歸類在右下象限。其中檢測到野生型和稀有變體的液滴表示為“++”且歸類在右上象限。其中僅檢測到稀有變體的液滴表示為且也歸類在右上象限。
[0022]定義
[0023]除非另外定義，本文中使用的技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。參見例如Lackie，DICT1NARY OF CELLANDMOLECULAR B1LOGY(《細胞分子生物學詞典》)，埃爾斯威爾出版社(Elsevier)(第4版2007) ; Sambrook等，MOLECULARCLONING,ALAB0RAT0RY MANUAL(《分子克隆，實驗室手冊》)，冷泉港實驗室出版社(冷泉港，紐約1989)。術語“一個”或“一種”意在表示“一個(種)或多個(種)”。當術語“包含”及其各種變體例如“包括”和“含有”位于敘述步驟或要素之前時，是用來表示添加其它的步驟或要素是任選的，并且是非排它性的。本發明的實踐中可以使用與本文所述類似或等價的任何方法、裝置和材料。提供的以下定義是用來幫助理解本文經常用到的某些術語，且不對本發明的范圍構成限制。
[0024]本文所用術語“劃分”或“劃分的”指將樣品分為多個部分或多個“劃分產物”。劃分產物可以是固體或流體。在一些實施方式中，劃分產物是固體劃分產物，例如微米或納米通道。在一些實施方式中，劃分產物是流體劃分產物，例如液滴。在一些實施方式中，流體劃分產物(如液滴)是不互溶的流體(如水和油)的混合物，或乳液。在一些實施方式中，流體劃分產物(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的運載體流體(如油)包圍。在其它實施方式中，流體劃分產物是與相鄰水性液滴在物理或化學上分開的水性液滴，使得一個液滴中的核酸、緩沖劑、鹽或其他分子不會擴散到相鄰液滴中。
[0025]術語“檢測試劑”指與靶分子相互作用或結合靶分子(如核酸)的分子(例如染料、蛋白質、核酸、適體等)。與靶分子相互作用或結合靶分子的分子的非限制性示例包括染料(如嵌入染料)、核酸(如寡核苷酸)、蛋白質(如抗體、轉錄因子、鋅指蛋白、非抗體蛋白支架等)和適體。
[0026]術語“序列特異性檢測試劑”指特異性結合特定序列或特異性檢測特定序列的分子(例如核酸、蛋白質、適體等)。在一些實施方式中，序列特異性檢測試劑可與非靶核酸具有交叉反應性。
[0027]術語“特異性結合”或“與……特異性相互作用”指檢測試劑(如寡核苷酸、適體或抗體)與靶序列的結合親和力比一種或多種非靶序列高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。本文中，較高的親和力可測量為例如較低的解離常數(Kd)。例如，特異性結合特定靶核酸的檢測試劑將通常以與一種或多種非靶核酸相比高至少10倍的親和力結合靶核酸(例如，Kd是與非靶核酸的Kd的1/10)。在一些情況中，該非靶核酸包括與靶核酸基本類似的核酸。例如，在一些情況中，該非靶核酸包括與靶核酸相差約I個核苷酸(例如相差1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)的核酸。作為另一個示例，該非靶核酸可包括與靶核酸基本類似的保守區域或結構域和基本不同的其他區域或結構域。在一些方面中，該非靶核酸包括與靶核酸基本不同的核酸。在一些情況中，特異性結合特定靶核酸的檢測試劑將與該靶核酸雜交，其解鏈溫度比與非靶核酸雜交時的解鏈溫度高至少0.5、1、2、5、10、15、20或25°(3。
[0028]在一些情況中，“特異性結合”或“與……特異性相互作用”指在復合混合物中結合并檢測靶序列但基本不結合或檢測非靶序列的檢測試劑(如寡核苷酸、適體或抗體)。例如，特異性結合靶序列的檢測試劑可不檢測或基本不檢測包含生物體或樣品的基因組或轉錄組的細胞裂解物或核酸制備物中存在的非靶核酸。
[0029]術語“非特異性檢測試劑”指結合或檢測總體核酸(例如總核酸、總擴增的核酸、總逆轉錄的核酸、總DNA或總雙鏈核酸)的分子。例如，非特異性檢測試劑可包括結合核酸的染料，如嵌入染料。或者，非特異性檢測試劑可包括結合或檢測摻入至核酸的通用序列的核苷酸。例如，可通過一種或多種含有可檢測序列的引物來擴增樣品中的核酸。該非特異性檢測試劑可檢測擴增反應期間納入的可檢測序列。在一些情況中，該非特異性檢測試劑可區分經擴增和未擴增的核酸。在其他情況中，該非特異性檢測試劑可區分單鏈和雙鏈核酸。在一些情況中，該非特異性檢測試劑可區分DNA和RNA。在一些情況中，該非特異性檢測試劑在結合核酸時發熒光或增加熒光。
[0030]術語“標記物”和“可檢測標記物”可互換地指可通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理手段檢測的組合物。例如，可用的標記物包括熒光染料、發光劑、放射性同位素(如32P、3H)、高電子密度試劑、酶、生物素、地高辛或半抗原以及