ogen)，The Handbook一A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies(《手冊(cè)--焚光探針和標(biāo)記技術(shù)指導(dǎo)》)，第10版(2005))。
[0072]熒光劑可包括多種有機(jī)和/或無(wú)機(jī)小分子或多種熒光蛋白及其衍生物。例如，熒光劑可包括但不限于:花青、酞菁、撲啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基咕噸、吩噻嗪、吩砸嗪、熒光素(例如FITC、5_羧基熒光素和6-羧基熒光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明紅)、吖啶、蒽醌、硫族卩比喃鐵(chalcogenopyrylium)類(lèi)似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊藍(lán)、氮雜甘菊藍(lán)、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、B0DIPY?和B0DIPY?衍生物，及其類(lèi)似物。在一些實(shí)施方式中，熒光劑是Alexa Fluor染料。在一些實(shí)施方式中，熒光劑是聚合物點(diǎn)或量子點(diǎn)。熒光染料和熒光標(biāo)記物試劑包括可購(gòu)自英杰/分子探針公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒同州尤金市)和皮爾斯生物技術(shù)公司(Pierce B1technology，Inc.)(伊利諾斯州洛克福德)。
[0073]在一些實(shí)施方式中，用于檢測(cè)靶分子的序列特異性檢測(cè)試劑都使用光學(xué)試劑標(biāo)記，且各光學(xué)試劑標(biāo)記的檢測(cè)試劑都通過(guò)檢測(cè)該光學(xué)試劑生成的信號(hào)來(lái)檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，非特異性檢測(cè)試劑使用光學(xué)試劑標(biāo)記并通過(guò)檢測(cè)該光學(xué)試劑生成的信號(hào)來(lái)檢測(cè)。
[0074]在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其發(fā)射γ射線、正電子、β和α粒子和X射線。合適的放射性核素包括但不限于: 225AC、72As、211At,11B,128Ba,212Bi,75Br,77Br,14C,109Cd,62Cu,64Cu,67Cu,18F,67Ga,68Ga,3H,166Ho,1231 ,1241 ,125I
^130K131KlllIn^177Lu^13N^15o^32p^33p^l2pb^103pd^186Re^188Re^47Sc^153Sm^89Sr^99mTc^88Y^p
9()Y。在一些實(shí)施方式中，用于檢測(cè)特異性核苷酸序列的序列特異性檢測(cè)試劑各自用放射性同位素標(biāo)記(例如使用第一放射性同位素標(biāo)記第一檢測(cè)試劑，使用第二放射性同位素標(biāo)記第二檢測(cè)試劑等)，且使用放射性同位素標(biāo)記的各檢測(cè)試劑通過(guò)檢測(cè)該放射性同位素生成的放射性來(lái)檢測(cè)。例如，一種檢測(cè)試劑可標(biāo)記有γ發(fā)射子，而一種檢測(cè)試劑可標(biāo)記有β發(fā)射子?；蛘?，這些檢測(cè)試劑可標(biāo)記有以可區(qū)分的不同能級(jí)發(fā)射同一粒子(例如，α、β或γ)的放射性同位素。在一些實(shí)施方式中，用于檢測(cè)靶分子的序列特異性檢測(cè)試劑都使用放射性同位素標(biāo)記，且各放射性同位素標(biāo)記的檢測(cè)試劑都通過(guò)檢測(cè)該放射性同位素生成的信號(hào)來(lái)檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，非特異性檢測(cè)試劑使用放射性同位素標(biāo)記并通過(guò)檢測(cè)該放射性同位素生成的信號(hào)來(lái)檢測(cè)。在一些情況中，該序列特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有放射性同位素且該非特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有光學(xué)試劑。在其他情況中，該序列特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有光學(xué)試劑且該非特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有放射性同位素。
[0075]在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記物是酶，并通過(guò)檢測(cè)該酶生成的產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)檢測(cè)試劑。合適的酶的示例包括但不限于:脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過(guò)氧化氫酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、
半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶和水解二乙酸熒光素的酯酶。例如，辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)可與生色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)聯(lián)用，其在過(guò)氧化氫存在下產(chǎn)生在450nm處可檢測(cè)的可溶產(chǎn)物。堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)可與生色底物對(duì)硝基苯基磷酸鹽聯(lián)用，其產(chǎn)生405nm處可檢測(cè)的可溶性產(chǎn)物。β-半乳糖苷酶檢測(cè)系統(tǒng)可與生色底物鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)聯(lián)用，產(chǎn)生在410nm處可檢測(cè)的可溶性產(chǎn)物。脲酶檢測(cè)系統(tǒng)可與底物如脲溴甲酚紫(西格瑪免疫化學(xué)品公司(Sigma Immunochemicals)，密蘇里州圣路易斯)聯(lián)用。
[0076]在一些實(shí)施方式中，序列特異性檢測(cè)試劑各自標(biāo)記有酶(例如第一探針標(biāo)記有第一酶，第二探針標(biāo)記有第二酶等)，且標(biāo)記有酶的各序列特異性檢測(cè)試劑通過(guò)檢測(cè)該酶生成的產(chǎn)物來(lái)測(cè)得。在一些實(shí)施方式中，所有用于檢測(cè)靶核酸的序列特異性檢測(cè)試劑都使用酶標(biāo)記，且各酶標(biāo)記的檢測(cè)試劑都通過(guò)檢測(cè)該酶生成的產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，非特異性檢測(cè)試劑使用酶標(biāo)記并通過(guò)檢測(cè)該酶生成的信號(hào)來(lái)檢測(cè)。在一些情況中，該序列特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有酶且該非特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有光學(xué)試劑或放射性同位素。在其他情況中，該序列特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有光學(xué)試劑或放射性同位素且該非特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記有酶。
[0077]在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記物是親和標(biāo)簽。合適的親和標(biāo)簽的示例包括但不限于:生物素、肽標(biāo)簽(如FLAG標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、Hi s標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、S標(biāo)簽、SBP標(biāo)簽、Strep標(biāo)簽)和蛋白質(zhì)標(biāo)簽(如GST標(biāo)簽、MBP標(biāo)簽、GFP標(biāo)簽)。
[0078]在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記物是核酸標(biāo)記物。合適的核酸標(biāo)記物的示例包括但不限于:寡核苷酸序列、單鏈DNA、雙鏈DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA雜交體。在一些實(shí)施方式中，該核酸標(biāo)記物的長(zhǎng)度是約10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或 1000個(gè)核苷酸。
[0079]在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記物是核酸條碼。如本文所用“條碼”是專一限定檢測(cè)試劑分子的或與檢測(cè)試劑結(jié)合的核酸分子的短核苷酸序列(例如，長(zhǎng)至少約4、6、8、10或12個(gè)核苷酸)。例如，可在不同劃分產(chǎn)物中使用含有不同條碼序列的引物擴(kuò)增劃分產(chǎn)物中的一種或多種核酸，從而將獨(dú)特的條碼摻入至不同劃分產(chǎn)物的經(jīng)擴(kuò)增的核酸中。類(lèi)似地，可在不同劃分產(chǎn)物中使用含有不同條碼序列的引物逆轉(zhuǎn)錄劃分產(chǎn)物中的一種或多種核酸，從而將獨(dú)特的條碼序列摻入至不同劃分產(chǎn)物的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的核酸中。替代地或組合地，劃分產(chǎn)物中的一種或多種核酸可連接至條碼，使得各劃分產(chǎn)物中具有不同的條碼序列。在一些情況中，序列特異性檢測(cè)試劑含有對(duì)不同劃分產(chǎn)物而言獨(dú)特的條碼。在一些情況中，非特異性檢測(cè)試劑可含有對(duì)不同劃分產(chǎn)物而言獨(dú)特的條碼。在一些情況中，序列特異性和非特異性檢測(cè)試劑都含有對(duì)不同劃分產(chǎn)物而言獨(dú)特的條碼。在這類(lèi)情況中，對(duì)于給定劃分產(chǎn)物中的特異性和非特異性檢測(cè)試劑，這些條碼可以是相同的。或者，對(duì)于給定劃分產(chǎn)物中的特異性和非特異性檢測(cè)試劑，該條碼可以是不同的。隨后可合并并任選擴(kuò)增劃分產(chǎn)物而不損失何種劃分產(chǎn)物含有核酸的痕跡。然后可對(duì)是否存在含有各條碼的核酸進(jìn)行計(jì)數(shù)(例如通過(guò)測(cè)序)而無(wú)需維持物理劃分產(chǎn)物。
[0080]條碼序列的長(zhǎng)度決定能區(qū)分多少獨(dú)特性樣品。例如，4個(gè)核苷酸的條碼能區(qū)分不多于44或256個(gè)樣品；6個(gè)核苷酸的條碼能區(qū)分不多于4096個(gè)不同樣品；而8個(gè)核苷酸的條碼能標(biāo)示不多于65536個(gè)不同樣品。此外，條碼可接合至雙鏈核酸的兩條鏈，例如通過(guò)用于從RNA模板中合成第一和第二鏈的條碼化引物，通過(guò)用于DNA擴(kuò)增的條碼化引物，或者通過(guò)連接。在兩條鏈上使用兩種不同的條碼增加了可區(qū)分的獨(dú)立事件的數(shù)量。
[0081]或者，相同條碼可接合至雙鏈核酸的第一和第二鏈。在各劃分產(chǎn)物中使用相同的條碼(例如通過(guò)在用于從RNA模板合成第一和第二鏈、連接的引物中摻入相同的條碼，或通過(guò)在DNA擴(kuò)增期間摻入)可在兩條鏈上產(chǎn)生相同的條碼。雙重條碼化可提供對(duì)混雜下游分析的后續(xù)檢測(cè)誤差如測(cè)序或擴(kuò)增誤差的檢驗(yàn)并且允許檢測(cè)任一條或兩條鏈中而不影響定量。本領(lǐng)域熟知條碼技術(shù)的應(yīng)用，參見(jiàn)例如Katsuyuki Shiroguchi等Digital RNA sequencingminimizes sequence-dependent bias and amplificat1n noise with optimizedsingle-molecule barcodes(數(shù)字式RNA測(cè)序用優(yōu)化的單分子條碼最小化序列依賴性偏置和擴(kuò)增噪音)，PNAS (2012)和Smith ,AM 等，Highly-multiplexed barcode sequencing: anefficient method for parallel analysis of pooled samples(高度多重條碼測(cè)序:一種對(duì)集中的樣品平行分析的高效方法)，Nucleic Acids Research Can 11,(2010)。
[0082]在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記物是“點(diǎn)擊”化學(xué)部分。點(diǎn)擊化學(xué)使用簡(jiǎn)單穩(wěn)健的反應(yīng)(如銅催化的炔和疊氮化物的環(huán)加成)來(lái)建立分子間連接。對(duì)于點(diǎn)擊化學(xué)的綜述，參見(jiàn)Kolb等，Agnew Chem 40: 2004-2021 (2001)。在一些實(shí)施方式中，點(diǎn)擊化學(xué)部分(如疊氮化物或炔部分)可使用另一種可檢測(cè)標(biāo)記物(例如帶熒光標(biāo)記物、生物素化或放射性標(biāo)記的炔或疊氮化物部分)來(lái)檢測(cè)。
[0083]接合可檢測(cè)標(biāo)記物與檢測(cè)試劑的技術(shù)是熟知的。例如，常見(jiàn)蛋白標(biāo)記技術(shù)的綜述可參見(jiàn)B1chemical Techniques: Theory and Practice(《生物化學(xué)技術(shù):理論和實(shí)踐》)，John F.Robyt和Bernard J.White，維弗蘭德出版公司(Waveland Press，Inc.)( 1987)。其他標(biāo)記技術(shù)綜述于，例如，R.Haugland，Excited States of B1polymers(《生物聚合物的激發(fā)態(tài)》)，Steiner編，普萊南出版社(Plenum Press)(1983) ；Fluorogenic Probe Designand Synthesis:A Technical Guide(《焚光探針設(shè)計(jì)與合成:技術(shù)指南》)，PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(PE Applied B1systems) (1996);以及G.T.Herman,B1conjugate Techniques(《生物偶聯(lián)技術(shù)》)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) (1996)。
[0084]在一些實(shí)施方式中，兩種或更多種檢測(cè)試劑標(biāo)記物(如第一標(biāo)記物、第二標(biāo)記物等)聯(lián)合生成可檢測(cè)信號(hào)，該可檢測(cè)信號(hào)是在一種或多種標(biāo)記物不存在時(shí)無(wú)法生成的。例如，在一些實(shí)施方式中，各標(biāo)記物是酶，且這些酶的活性聯(lián)合生成可檢測(cè)信號(hào)來(lái)指示是否存在標(biāo)記物(并因此指示各結(jié)合核酸的檢測(cè)試劑)。聯(lián)合生成可檢測(cè)信號(hào)的酶的示例包括成對(duì)的試驗(yàn)，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的成對(duì)試驗(yàn)；以及針對(duì)與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、β-D-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶試驗(yàn)偶聯(lián)的NAD(P)H的化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)。參見(jiàn)例如Maeda等，J B1luminChemilumin 1989,4:140-148。
[0085]檢測(cè)核酸的方法
[0086]在一些實(shí)施方式中，提供了一種核酸序列檢測(cè)方法，包括:
[0087]提供包含DNA或RNA核酸的樣品；
[0088]將所述樣品劃分為一組混合物劃分產(chǎn)物；
[0089]使用序列特異性檢測(cè)試劑檢測(cè)劃分產(chǎn)物中是否存在靶核酸；以及
[0090]使用非特異性檢測(cè)試劑檢測(cè)劃分產(chǎn)物中是否存在雙鏈核酸，
[0091 ]從而檢測(cè)劃分產(chǎn)物中靶核酸與總核酸的比率。
[0092]在一些實(shí)施方式中，提供了一種核酸序列檢測(cè)方法，包括:
[0093]提供包含DNA或RNA核酸的樣品，該DNA或RNA核酸包含第一靶標(biāo)和第二靶標(biāo)；
[0094]將所述樣品劃分為一組混合物劃分產(chǎn)物；以及
[0095]使用結(jié)合第一靶標(biāo)的特異性檢測(cè)試劑和結(jié)合兩種靶標(biāo)的非特異性檢測(cè)試劑來(lái)檢測(cè)至少一個(gè)混合物劃分產(chǎn)物中的第一靶標(biāo)和第二靶標(biāo);從而確定樣品中第一靶標(biāo)的濃度以及第一和第二靶標(biāo)的濃度。
[0096]提供樣品
[0097]可從基本上任何生物來(lái)源提供樣品。樣品可含有核酸或靶核酸。提供樣品包括獲得樣品和制備樣品用于本發(fā)明所述方法。例如，可對(duì)樣品進(jìn)行純化、分級(jí)、富集或過(guò)濾。在一些情況中，可對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或連接。在一些情況中，提供樣品并在劃分步驟前使樣品接觸檢測(cè)試劑(如序列特異性檢測(cè)試劑、非特異性檢測(cè)試劑或其組合)。在一些情況中，劃分樣品并隨后使