再用15ml的二氯甲烷洗滌并過濾3次，濾液合并后減壓抽干，殘余物用 15ml的乙醚洗滌3次，抽濾收集乙醚不溶的固體，干燥后即得多西紫杉醇-2'-丁二酰-維瑞 肽偶合物純品即DTX-1-維瑞肽偶合物，收率達到96.1 %JPLC: 18.22min，MS: 2022.3 [M+H ]+,Mw： 2021.32 (C104H125N13O25) 〇 [0087]實施例3DTX-5-維瑞肽偶合物的合成
[0088] 將與固相合成樹脂NH2-Rink-Linker-Resin相連，用-Trt基團保護的巰基(-SH)在 I2/DIEA條件下可在固相合成樹脂上形成分子內二硫鍵，在Pd[P(C6H5)3]4/C6H5SiH3條件下選 擇性脫除烯丙甲酯基，得到側鏈N-端氨基受保護、Lys5-端氨基游離的維瑞肽樹脂(含有維 瑞肽0.2mmol)，將其置于固相合成反應器中，用無水二氯甲烷浸洗后抽取溶劑并通入干燥 氮氣。將多西紫杉醇-2 ' -丁二酸酯(0.454g，0.5mmo1)溶于無水二氯甲燒(20ml)，加入PyBop (0.312,0.60111111〇1)，叱^二甲基甲酰胺(0.0598,0.80111111〇1)，并攪拌15分鐘后，滴入上述固 相合成反應器中并用干燥氮氣進行攪拌。1.2小時后將溶劑抽干，將樹脂依次用10ml的二甲 基甲酰胺洗滌6次，20ml二氯甲烷洗滌5次，10ml乙醚洗滌3次后減壓濃縮，抽干多余溶劑。將 干燥的樹脂加入40ml的質量分數為5%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，在溫度為23°C，攪拌 速度為400r/min的條件下，攪拌反應1小時后過濾，將過濾物用30ml的二氯甲烷洗滌并過濾 3次，合并上述濾液后減壓抽干，殘余物用30ml的乙醚洗滌3次，抽濾收集乙醚不溶的固體， 干燥后即得到目標產品：多西紫杉醇_2'_丁二酰-維瑞肽偶合物純品即DTX-5-維瑞肽偶合 物，收率達到96 · 1 %DHPLC: 18 · 25min，MS: 2022 · 5[M+H] +，Mw: 2021 · 32(CiQ4Hi25Ni3〇25)。
[0089] 實施例4(DTX)2-維瑞肽偶合物的固相合成
[0090] 將維瑞肽-Lys5(DTX-Linker-NH)-固相合成樹脂（含有維瑞肽0.15mmol)溶于12ml 的無水二氯甲烷后加入固相合成反應器中，再加入0.5mlH0Ct、4.0mlDMC、4mlDIC、 0.5mlDIEA混合溶劑，室溫攪拌，不斷滴加多西紫杉醇-2 ' -丁二酸酯(DTX-Linker，0.17g， 0.18mol)，在反應溫度為23°C、攪拌速度為450r/min的條件下攪拌反應1.0小時，進行減壓 蒸餾，將殘余物滴入150ml冰水中，抽濾收集水中析出的固體并用40ml蒸餾水洗滌3次，所得 固體用50ml乙醚重結晶后，加入40ml質量分數為5%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，攪拌lh后 過濾，再用20ml無水二氯甲烷洗滌過濾，濾液合并后減壓濃縮，殘余物用80ml乙醚洗滌3次， 抽濾收集溶劑不容的固體，干燥得到純凈的目標產物〇 . 407g，收率為93 . 1 %dPLC: 23 · 21min，MS: 2912 · 8[M+H] +，Mw: 2911 · 21 (Ci5iHi8〇Ni4〇4i) 〇[0091]實施例5(DTX)2-維瑞肽偶合物的液相合成
[0092]DTX-5-維瑞肽偶合物0.202g(0.1mmol)加入無水二甲基甲酰胺6ml。將多西紫杉 醇-2'-丁二酸酯（0·llmg，0.12mmol)溶于DIEA(6ml)加入0.5ml的H0Ct，5.0ml的DIC攪拌 12min后滴入上述溶液。在反應溫度為24°C、攪拌速度為400r/min的條件下，反應1.2小時， 將反應后的溶液減壓濃縮除去DIEA，將殘余物滴入80ml的冰水中，抽濾收集水中析出的固 體并用20ml的蒸餾水洗滌3次。所得固體用甲醇-乙酸乙酯重結晶，得(DTX)2-維瑞肽偶合物 純品0 · 269g，收率為92 · 4%DHPLC: 22 · 96min，MS: 2912 · 5[M+H] +，Mw: 2911 · 21 (Ci5iHi8〇Ni4〇4i)。
[0093]生物活性實施例
[0094]實施例6實施例2-4產物的大鼠急性毒性試驗
[0095]實驗動物:Wistar大鼠40只，雌性，體重180-220g，購自山東大學實驗動物中心，生 產許可號：SCXK(魯)20130009,飼養于IVC獨立送回風系統中，飼料購自北京華阜康生物科 技有限公司；
[0096]劑量選擇及受試物給與方式:尾靜脈注射0.5ml/只，最高劑量定為2.5mg/kg。將 40只大鼠隨機分為10組，劑間距設為1:0.6，最高劑量組(2.5mg/kg)、中劑量組（1.5mg/kg)、 低劑量組(〇.9mg/kg)、對照組(等體積生理鹽水），動物隨機分為10組，每組4只，其中高、中、 低劑量組分別分為3組，對照組1組。
[0097]實驗方法：以0.9 %生理鹽水將實施例2-4制備的多西紫杉醇-維瑞肽偶合物:DTX-1-維瑞肽偶合物、DTX-5-維瑞肽偶合物、（DTX)2-維瑞肽偶合物分別配制不同濃度的注射 液，每種偶合物注射液的濃度分別為：lmg/ml，0.6mg/ml，0.36mg/ml。注射前16小時禁食不 禁水，注射完畢2小時后喂食。按分組情況，分別給每組大鼠尾部靜脈注射相應偶合物及相 應濃度的樣本或〇. 9%生理鹽水1次，進針后緩慢推注，用時80s-100s。
[0098]實驗結果:最高劑量為2.5mg/kg，經給大鼠尾靜脈注射一次后，兩周內觀察動物生 命體征、進食、飲水、活動、死亡情況及其他毒性反應，未見動物死亡及肉眼可見的毒副作 用。動物活動正常，體重增加，顯示出三種多西紫杉醇維瑞肽偶合物:DTX-1-維瑞肽偶合物、 DTX-5-維瑞肽偶合物、（DTX)2_維瑞肽偶合物毒性較小。
[0099]實施例7實施例4產物的細胞毒性試驗
[0100] 細胞培養:A549細胞用含10%小牛血清的1640培養液置于含5%0)2的37°(3培養箱 中培養，布滿培養瓶時，用〇. 05 %的胰蛋白酶(含0.02 %EDTA)消化為單細胞懸液后傳代，2-3次/周。
[0101] 透射電鏡檢測細胞凋亡形態:將A549細胞(5X105/ml)接種于6孔板中，200yL/孔， 過夜后換含有l〇〇〇nmol/L的(DTX)2-維瑞肽偶合物的1640培養液繼續培養;在培養0h、24h、 48h、72h時分別收集活體細胞，并分別進行胰蛋白酶消化、離心收集細胞，用戊二醛固定，次 日取出固定好的細胞樣品，用0.lmo1 /L磷酸緩沖液(pH7.4)沖洗，再用鋨酸再次固定，用緩 沖液沖洗。隨后用梯度乙醇脫水，用無水丙酮置換，包埋液浸透過夜。之后用618#環氧樹脂 包埋，聚合，修組織塊等一系列過程后用萊卡UC6型超薄切片機切片，用醋酸鈾-檸檬酸鉛進 行雙染色，日產Hitachi-500電子透射顯微鏡觀察并拍照。
[0102]實驗結果:經(DTX)2-維瑞肽偶合物處理的非小細胞肺癌A549細胞，24h后一些細 胞貼壁，體積增大，折光性不好，72h后有50%的細胞皺縮、漂浮，并形成凋亡小體。凋亡細胞 變化特征有兩種:一種為間期凋亡特點，細胞核染色質固縮，聚集于核邊，胞漿濃縮，有空泡 形成；另一種為分裂期凋亡特征，主要為染色體散亂分布在細胞中，細胞膜出泡，進而染色 體聚集成團，形成凋亡小體，到后期凋亡小體及殘留的凋亡細胞進行次級壞死。透射電鏡下 (DTX)2-維瑞肽偶合物處理后A549細胞的凋亡過程見附圖2。
[0103] 實施例8實施例2-5產物及DTX對A549細胞的影響
[0104] 原料準備：將實施例2-5產物：DTX-1-維瑞肽偶合物、DTX-5-維瑞肽偶合物、 (DTX)2-維瑞肽偶合物與多西紫杉醇(DTX)分別溶解于無水乙醇，保持于-20°C待用。
[0105] 細胞培養:A549細胞用含10%小牛血清的1640培養液置于含5%0)2的37°(3培養箱 中培養，布滿培養瓶時，用〇. 05 %的胰蛋白酶(含0.02 %EDTA)消化為單細胞懸液后傳代，2-3次/周。
[0106] 實驗操作：將細胞（5X105/ml)接種于6孔板中，200μLν孔，過夜后換含有100、 1000nm〇l/L的DTX及其偶合物的1640培養液繼續培養;在培養24h、72h時分別收集細胞，磷 酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，固定、染色后200目篩網過濾，流式細胞儀測定細胞凋亡情況，計算 凋亡細胞比率（％)。
[0107] 統計學處理:數據的表達采用ff±s表示，采用SPSS13.0軟件進行統計分析，數據 比較采用t檢驗，以P〈0.05為有顯著性差異。
[0108] 實驗結果及分析:三種多西紫杉醇維瑞肽偶合物及DTX對A549細胞凋亡率的影響 呈濃度和時間依賴性，實驗結果見附圖3;由附圖3中的實驗數據可以看出三種多西紫杉醇 維瑞肽偶合物及DTX對A549細胞凋亡的影響呈時間與濃度依懶性;在相同藥物濃度條件下， 隨著藥物作用時間延長，A549細胞凋亡率逐漸升高，且具有顯著性差異(p〈0.05);相同濃度 藥物培養A549細胞相同時間時，（DTX)2-維瑞肽偶合物誘導細胞的凋亡率顯著高于DTX、 DTX-1-維瑞肽偶合物、DTX-5-維瑞肽偶合物，且具有顯著性差異(P〈0.05);在相同濃度下作 用相同時間，三種多西紫杉醇維瑞肽偶合物的細胞凋亡率顯著高于DTX;在相同濃度下作用 相同時間，DTX-1-維瑞肽偶合物與DTX-5-維瑞肽偶合物，A549細胞凋亡率相當；由此可見， 本發明專利產品多西紫杉醇維瑞肽偶合物與DTX相比更利于促進非小細胞肺癌A549細胞的 凋亡。
[0109]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，所作出了任何修改、等同替換、改進等，都應視為屬于本發明 的保護范圍。
【主權項】
1. 一種多西紫杉醇維瑞肽偶合物，其特征在于:所述的多西紫杉醇在2 '位羥基通過鏈 接序列與維瑞肽的氨基相連。2. 根據權利要求1所述的多西紫杉醇維瑞肽偶合物，其特征在于:所述連接劑為!100(：- (CH