多西紫杉醇維瑞肽偶合物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及多西紫杉醇的多肽偶合物及其制備方法，具體涉 及多西紫杉醇維瑞肽偶合物及其制備方法和在治療腫瘤方面的應用。
【背景技術】
[0002] 多西紫杉醇(D〇CetaXel，DTX)是以歐洲紅豆杉的針葉萃取物為基礎半合成得到的 繼紫杉醇后又一新型的抗癌藥物。該藥物的作用機制是提高微管蛋白聚合作用和抑制微管 解聚作用，阻滯細胞于G和Μ期，從而抑制癌細胞的有絲分裂和增值(F.V.Fossellaetal.， PhaseIIstudyofdocetaxelforadvancedormetastaticplatinum-refractory non-small-celllungcancer.JournalofClinicalOncology，1995，13,645-651) 〇與紫 杉醇相比，在體外抗腫瘤活性實驗中，已證實多西紫杉醇的活性是紫杉醇的1.3~12倍 (S.Noguchi,Predictivefactorsforresponsetodocetaxelinhumanbreast cancers·CancerScience，2006，97，813-820)，目前已獲得Π)Α批準用于臨床上治療乳腺 癌、卵巢癌、非小細胞肺癌和前列腺癌等。但是多西紫杉醇與普通化藥一樣，存在選擇性低、 毒副作用大、水溶性差的缺點，嚴重影響了藥物藥效；由于多西紫杉醇在體內分布廣泛，尤 其是在正常器官和組織中有較多的分布，不僅給患者帶來了痛苦，更降低了藥物生物利用 度。此外，多西紫杉醇在水中的溶解性較差(小于lyg/ml)，極大的影響了藥效的發揮，目前 上市的劑型多利用非離子型表面活性劑吐溫-80增溶，經13%的乙醇稀釋后注射使用。但是 吐溫-80具有溶血性且粘度較大，在臨床應用中，以發現該制劑具有外周神經毒性和肌肉 骨豁毒性，以及中性粒細胞減少等一系列過敏反應(J.Baker，etal.，Docetaxel_related sideeffectsandtheirmanagement.EuropeanJournalofOncologyNursing,2009, 13,49-59)。因此，解決多西紫杉醇的選擇性低、水溶性差等問題，控制該藥物釋放速率及提 高靶向性，對于提高多西紫杉醇抗癌活性具有重要意義。
[0003]當前，因靶向化療比全身化療具有高效低毒的特點，而成為當前癌癥治療的研究 熱點，Schally等將阿霉素連接在生長抑素類似物上，合成了偶聯藥物AN-238,通過多種動 物實驗模型發現，AN-238對高表達SSTR的腫瘤組織具有靶向性和毒性，對正常細胞具有低 毒性，甚至在表達相對較低密度SSTR的腫瘤模型中比它們相應的細胞毒素基團更有效且毒 性更低。Moody等將喜樹堿偶聯在生長素類似物上，通過小細胞肺癌NCI-H69細胞的體外實 驗，證實偶聯物既保留了與SSTR2(生長抑素受體)高度的親和力，又保持了其生長抑素類似 物的活性。將化療藥物與生長抑素類似物連接，對于表達SSTR的腫瘤具有廣闊的治療前景 與極高的醫學價值。
[0004] 維瑞肽是化學合成的生長抑素的八肽類似物，與SSTR2、SSTR3及SSTR5具有更強的 結合力，選用維瑞肽與化療藥物偶聯可以有效實現靶向治療腫瘤細胞。此外，維瑞肽作為生 長抑素類似物，本身也具有直接和間接的抗腫瘤作用。
[0005]隨著多西紫杉醇的臨床廣泛應用，其在臨床顯現的不良反應如:骨髓抑制、神經毒 性等越來越明顯，可以解決多西紫杉醇水溶性差、選擇性低、毒副作用大的缺點，臨床亟需 一種新型的靶向抗癌化合物為廣大的腫瘤患者減輕了經濟與精神負擔。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供多西紫杉醇維瑞肽偶合物，所述的多西紫杉醇維瑞肽偶 合物是新型的靶向抗癌藥物，從根本上解決了多西紫杉醇選擇性低、毒副作用大、水溶性差 等缺點，具有選擇性高、水溶性好、毒副作用小、藥效高等優異性能。
[0007]本發明的另一目的是提供上述多西紫杉醇維瑞肽偶合物的制備方法。
[0008] 本發明的又一目的是提供上述多西紫杉醇維瑞肽偶合物在制備抗腫瘤藥物中的 應用。
[0009] 本發明公開了多西紫杉醇維瑞肽偶合物，所述的偶合物是由多西紫杉醇在2'位羥 基通過鏈接序列與維瑞肽氨基相連而得。
[0010] 所述的多西紫杉醇的結構式為：
[0012 ] 所述的連接序列為:H00C-(CH2)n-COOH;
[0013]其中，n= 2-12。
[0014]所述小分子多肽維瑞肽的結構式為：
[0016] 所述的多西紫杉醇維瑞肽偶合物為:DTX-1_維瑞肽偶合物、DTX-5-維瑞肽偶合物、 (DTX) 2_維瑞肽偶合物中的一種。
[0017] 進一步，所述的DTX-1-維瑞肽偶合物的結構式為：
[0019]進一步，所述的DTX-5-維瑞肽偶合物的結構式如下：
[0021]進一步，所述的(DTX)2_維瑞肽偶合物的結構式如下：
[0023]本發明還公開了上述多西紫杉醇維瑞肽偶合物的制備方法，所述技術方案如下： [0024] (1)中間體DTX-Linker的化學合成，合成路線如下：
[0026] 具體操作方法如下：
[0027] 1)將多西紫杉醇溶于無水二氯甲烷，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，丁二酸酐，在 一定條件下反應一段時間后加入乙酸乙酯，并用鹽酸調至PH3-4,反應液依次用水萃取3次、 飽和食鹽水萃取1次，最后用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓回收乙酸乙酯；
[0028] 2)所得殘余物用丙酮-乙醚重結晶，即得到目標產物多西紫杉醇_2'_丁二酸酯純 品（中間體DTX-Linker)。
[0029]上述操作的有益效果是:選用的無水二氯甲烷溶劑為關鍵性溶劑，該溶劑可以使 多西紫杉醇完全溶解，并促進與丁二酸酐充分的接觸，提高反應效率，副產物少。
[0030]進一步，所述的操作方法中，所述的步驟1)中無水二氯甲烷溶劑與4-二甲基氨基 吡啶(DMAP)的體積比范圍為（11:1)-(15:1)，其中無水二氯甲烷與DMAP的最佳體積比是12: 1〇
[0031]進一步，所述的操作方法中，所述的步驟1)中反應條件為:反應溫度為：（0-10)°C， 轉速為：（200-800)r/min，攪拌時間為：（18-36)h，其中反應溫度為8°C、轉速為450r/min，攪 拌時間為24h為最佳，此反應條件的有益效果是，多西紫杉醇與丁二酸酐的反應更加充分， 目標產物收率高。
[0032] (2)多西紫杉醇維瑞肽偶合物的化學合成
[0033]將DTX-Linker與維瑞肽反應合成不同類型的多西紫杉醇-維瑞肽偶合物即：DTX-1-維瑞肽偶合物、DTX-5-維瑞肽偶合物、（DTX)2-維瑞肽偶合物，整體的工藝路線圖見說明 書附圖1。
[0034]進一步，所述的DTX-1-維瑞肽偶合物的合成路線如下：
[0036]具體實驗操作方法為：
[0037] 1)選用特殊的固相合成樹脂，用_Trt基團保護的巰基(-SH)在I2/DIEA條件下可在 固相合成樹脂上形成分子內二硫鍵，用側鏈保護的維瑞肽樹脂在特定的脫除劑作用下，選 擇性脫除N-端的Fmoc-氨基保護基，得到-Lys5-側鏈氨基受保護、N-端側鏈氨基酸游離的維 瑞肽樹脂，并將其置于固相合成反應器中，用無水二氯甲烷浸洗后抽取溶劑并通入干燥氮 氣；
[0038] 2)將多西紫杉醇_2'_丁二酸酯(DTX-Linker)溶于無水二氯甲烷，加入特定的高 效偶合試劑，低速攪拌l〇min后，滴入上述通有氮氣的固相合成反應器中，在特定條件下反 應一段時間；
[0039] 3)將反應后溶液減壓濃縮，將濃縮液依次用二甲基甲酰胺洗滌6次，用二氯甲烷洗 滌5次，用乙醚、石油醚、環己烷、正己烷中的一種或任意比例的混合溶劑洗滌3次，再次減壓 濃縮除去多余溶劑即得到DTX-Linker-NH-維瑞肽-固相合成樹脂；
[0040] 4)目標產物從固相合成樹脂上解離步驟如下：將干燥樹脂加入一定的溶劑中，攪 拌1小時后過濾；
[0041] 5)目標產物純化步驟如下:過濾物再用無水二氯甲烷洗滌過濾，合并上述濾液后 減壓濃縮，濃縮物用溶劑萃取，抽濾收集溶劑不溶的固體，干燥后得到純凈的目標產物DTX-1-維瑞肽偶合物。
[0042] 進一步，所述操作方法中，所述步驟1)中N-端氨基保護基脫除劑為吡啶的N，N_二 甲基甲酰溶液，吡啶的質量分數為15%-35 %，其中最佳質量比為20% ;采用上述脫除劑的 有益效果為：在脫除N-端保護基的同時，其它保護基不受影響，確保了目標產物的高效合 成。
[0043]進一步，所述操作方法中，其特征在于:所述的反應步驟1)中的特定脫除劑為P比啶 的N，N-二甲基甲酰溶液，其中吡啶的質量分數為15 % -35 %，以20 %為最佳。
[0044] 進一步，所述操作方法中，所述的步驟2)中溶解DTX-Linker的溶劑二氯甲烷可用 無水二氯乙烷替換，其中無水二氯乙烷與無水二氯甲烷的替換摩爾比為：（1:1)-(3:1);特 定的高效偶合試劑為恥(^、01(：、01(：、0此4按一定比例的混合溶劑，其中￥麗^隱*=(5 :1)-(10:1),Vdic：Vdiea=(3:1)-(8:1)〇
[0045] 進一步，所述操作方法中，所述的步驟2)中反應條件為:反應溫度為：（20-35 )°C， 攪拌速度為：（200-800 )r/min，攪拌時間為：（5-30 )min，其中最佳反應條件為:反應溫度為 25°C，攪拌速度為540r/min，攪拌時間為lOmin。
[0046] 進一步，所述操作方法中，所述步驟4)中解離溶劑為2%-10%三氟乙酸的二氯甲 烷溶液，其中最佳質量比為5%;所述步驟4)中解離反應條件如下:反應溫度為：（20-25)°C， 攪拌速度為：（300-800)r/min，攪拌時間為：（0.8-1.5)h，其中最佳條件為:其中最佳反應條 件為:反應溫度23°C，攪拌速度為:450r/min，攪拌時間為：1.Oh，本操作的有益效果是:將目 標產物從樹脂上切除，同時避免了目標產物結構遭到破壞，確