生物素修飾的適配體相結合，蔗糖酶和互補DNA相結 合；將DNA-鹿糖酶聚合物通過互補DNA與適配體堿基互補配對的原則固定到磁球表面；當 溶液中含有所需檢測目標分子時，目標分子與適配體特異性結合，從而將DNA-蔗糖酶聚合 物從磁球上釋放到溶液中；用磁分離器分離溶液，釋放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能夠 高效水解鹿糖為葡萄糖，從而通過血糖儀進行定量檢測。由于被釋放到溶液中的DNA-鹿糖 酶的量能夠通過葡萄糖的量來表示，并且蔗糖酶的量與樣品中目標分子的量存在一定的比 例關系。因此，血糖儀的讀數能夠被用來定量目標分子的濃度。
[0072] 2. 2緩沖液中AFBl的檢測
[0073] 結果如圖2所示，隨著AFBl濃度的增加，血糖儀的信號值也在逐步增加。當AFBl 的濃度在2. 5 X KT8M~4. OX 10 6M范圍時，血糖儀的信號值有一個良好的線性關系，線性 回歸方程為：y = 6. 08x+l. 8213, R2= 0. 9958,其中X表示AFBl的濃度，y表示血糖儀示數 的變化值，R是回歸系數。最低檢測限是5. 9ng/ml。
[0074] 歐洲食品安全局規定了黃曲霉毒素的最大限量值，AFBl在食品中限量范圍是0~ 12. O μ g/kg。中國現行的GB2761-2011 "食品中黃曲霉毒素的限量標準"和其他標準規定 在嬰幼兒谷類輔助食品中黃曲霉毒素 Bl的限量標準是0. 5 μ g/kg，在玉米，花生及其制品 中（花生油除外）黃曲霉毒素 Bl的限量是20 μ g/kg，在大米和食用油中限量是10 μ g/kg， 在其他谷物、豆類、發酵食品中限量是5 μ g/kg。因此，本發明方法的檢出限除嬰幼兒輔助食 品以外基本能滿足檢測要求。
[0075] 當黃曲霉毒素 Bl的濃度為25 μM時進行3次平行重復實驗，相對標準偏差在 1.5%。結果表明，該方法具有良好的重現性。
[0076] 此外，合成的適配體生物傳感器被保存在4°C冰箱里7天，每天取出一等份用于檢 測實驗，檢測到血糖儀信號值與剛合成時的檢測值沒有顯著差異。
[0077] 2. 3選擇性分析
[0078] 為了研究該傳感器的選擇性，選擇了六種霉菌毒素（AFMpAFGpAFGrAFB2WTA and ZEA)進行選擇性實驗，空白對照組（Control)不含有任何霉菌毒素，AFBl和其他霉菌毒素 的濃度被設定在lppm。結果如圖3所示，空白對照組有一個較低的信號值（0. 7mM)為本底 值，除AFBl以外的六種單一的霉菌毒素的血糖儀檢測值與空白對照組的血糖儀檢測值沒 有明顯差異，混合組I(MIXl)的血糖儀信號值略高于空白對照組信號值，但是差異不顯著。 AFBl和混合組2 (MIX2)的血糖儀信號值明顯高于空白對照組，混合組2 (MIX2)的血糖儀信 號值略低于AFBl組，可能由于混合毒素中某些毒素影響了 AFBl與AFBl適配體的結合，導 致釋放的DNA-蔗糖酶的量減少，從而水解蔗糖為葡萄糖的量相應地減少，進而產生偏低的 血糖儀信號值。結果表明，AFBl適配體傳感器除了 AFBl之外不會與其他六種霉菌毒素特 異性結合。然而，其他的霉菌毒素的存在可能會干擾AFBl和適配體之間的結合反應，導致 包含有AFBl的混合組2檢測濃度偏低。結果表明，本發明適配體傳感器在AFBl的檢測中 具有良好的特異性，不識別其他的霉菌毒素。
[0079] 實施例2適配體生物傳感器的合成
[0080] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0081] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0082] 取 300 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)與 0· 5mg sulfo-SMCC混合，禍旋震蕩 5min， 放置恒溫混勻儀上，室溫反應lh。
[0083] I. I. 2DNA分子的活化
[0084] 取 80 μ 1 100 μ M 互補 DNA (thiol-DNA，3' -SH-A12-CAACCCGTGCACA-5'），1 μ 1 0.1 M buffer Β，1 μ I 30mM TCEP (超純水）加入到I. 5ml離心管中，渦旋混勻，放置恒溫混 勻儀上，室溫反應0. 5h。
[0085] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0086] 將蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反應溶液離心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分別加入到超濾管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，離心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗滌8次；將8次離心洗滌后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分別從超濾管中吸出，轉移到1.5ml的離心管中，渦旋混勻，室溫放置恒溫混勻儀 上反應24h。
[0087] I. 2DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0088] I. 2. 1磁球和AFBl適配體的鏈接
[0089] 取0. 5ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球（MBs)放置磁分離器上至完全澄清，吸除 上清液，用 buffer B 洗滌 2 次；取 40 μ 1 0· ImM AFBl 適配體（5' -GTTGGGCACGTGTTGTCTCT CTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3')(超純水）加入到磁球溶液中，輕微渦旋 混勻，放置恒溫混勻儀上，室溫反應〇. 5h，用buffer B洗滌3次。
[0090] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗滌
[0091] 將反應后的DNA-蔗糖酶用超過濾器Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)離心， 用buffer A洗滌8次。
[0092] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0093] 將洗滌后的DNA-蔗糖酶溶液轉移到磁球-aptamer溶液中，渦旋混勻，放置恒 溫混勻儀上，室溫反應0. 5h，用buffer B洗滌3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物 (Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成適配體生物傳感器系統。
[0094] 實施例3適配體生物傳感器的合成
[0095] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0096] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0097] 取 500 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)與 2mg sulfo-SMCC 混合，禍旋震蕩 5min， 放置恒溫混勻儀上，室溫反應3h。
[0098] 1 · 1 · 2DNA分子的活化
[0099] 取 120 μ 1 100 μΜ 互補 DNA(thiol-DNA，3' -SH-A12-CAACCCGTGCACA-5'），3 μ 1 0.1 M buffer Β，3 μ I 30mM TCEP(超純水）加入到1.5ml離心管中，渦旋混勻，放置恒溫混 勻儀上，室溫反應2h。
[0100] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0101] 將蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反應溶液離心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分別加入到超濾管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，離心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗滌8次；將8次離心洗滌后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分別從超濾管中吸出，轉移到I. 5ml的離心管中，渦旋混勻，室溫放置恒溫混勻儀 上反應72h。
[0102] I. 2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0103] 1. 2. 1磁球和AFBl適配體的鏈接
[0104] 取2ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球（MBs)放置磁分離器上至完全澄清，吸除上 清液，用 buffer B 洗滌 2 次；取 80 μ 1 0· ImM AFBl 適配體（5' -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCT GTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3^ )(超純水）加入到磁球溶液中，輕微渦旋混 勻，放置恒溫混勻儀上，室溫反應2h，用buffer B洗滌3次。
[0105] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗滌
[0106] 將反應后的DNA-蔗糖酶用超過濾器Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)離心， 用buffer A洗滌8次。
[0107] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0108] 將洗滌后的DNA-蔗糖酶溶液轉移到磁球-aptamer溶液中，渦旋混勻，放置 恒溫混勻儀上，室溫反應2h，用buffer B洗滌3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物 (Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成適配體生物傳感器系統。
[0109] 實驗例1適配體生物傳感器反應條件的優化
[0110] 1、實驗方法
[0111] 1. 1反應溫度的優化
[0112] 對應用實施例1開發的適配體生物傳感器檢測AFBl的實驗過程中整個實驗溫度 進行優化。
[0113] 因為固定DNA-蔗糖酶到磁球上是通過DNA分子雜交完成的，它們之間的親和力跟 溫度有關，從而直接影響AFBl的檢測。此外，蔗糖酶的活性與溫度也有很大關系。本實驗 選擇了兩個最常用實驗溫度4°C和25°C，AFBl的濃度為12. 5 μΜ，孵育時間為30min，反應 時間為〇、lh、2h、3h、4h、5h。蔗糖酶水解蔗糖成葡萄糖，然后通過血糖儀定量檢測。
[0114] 1.2孵育時間的優化
[0115] 生物傳感器與目標分子的孵育時間是非常重要的，直接關系到釋放的DNA-蔗糖 酶的量。因此，在AFBl存在的情況下，對DNA-蔗糖酶釋放的動力學進行了研究。將含有 AFBl的樣品溶液與AFBl的適配體傳感器進行混合，在不同濃度下（6. 25、12. 5、25、50、100、 200、400 μΜ的AFBl)，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶在不同的時間里（15、30min)被磁性分 離，然后與蔗糖溶液混合相同的時間（30min)，水解蔗糖成葡萄糖，通過血糖儀定量檢測。
[0116] 2、實驗結果
[0117] 2. 1反應溫度的優化
[0118] 結果如圖4所示，當與蔗糖溶液在25°C孵育時，血糖儀的信號值快速增加，基本成 一個穩定的線性關系；當與蔗糖溶液在4°C孵育時，血糖儀的信號值在一個較低的水平，表 明酶的活性很低，被水解的蔗糖的量較少。因此，從實驗結果來看蔗糖酶的活性在25°C時 實驗效果更好。本發明確定整個實驗溫度均為25°C。
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