生物傳感器檢測黃曲霉毒素 Bl具有良好的重 現性。特異性分析結果表明，AFBl適配體傳感器除了 AFBl之外不會與其他六種霉菌毒素 (AFMp AFGp AFG2、AFB2、OTA和ZEA)特異性結合，說明本發明適配體傳感器在AFBl的檢測 中具有良好的特異性。
[0028] 本發明適配體生物傳感器檢測嬰幼兒配方米粉中黃曲霉毒素 B1，結果表明，AFBl 的回收率在84. 7%~118. 7%，表明本發明適配體傳感器可用于快速定量檢測食品中的 AFBl0
[0029] 本發明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0030] 本發明開發了一種適配體生物傳感器結合血糖儀定量檢測黃曲霉毒素 Bl的方 法。本發明適配體生物傳感器通過其適配體特異性的識別黃曲霉毒素 B1，釋放生物傳感器 上結合的蔗糖酶分子到溶液中，蔗糖酶能夠高效的水解蔗糖為葡萄糖，從而通過血糖儀進 行定量檢測。該方法具有操作簡便，檢出限低，特異性好，重復再現性好等優點，為食品中黃 曲霉毒素 Bl的定量檢測提供了一種新方法，具有良好的應用前景。
[0031] 本發明所涉及到的術語宙義
[0032] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0033] 術語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生 的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包 括PNA(肽核酸）、在反義技術中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡并 密碼子取代）和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以 上所選（或所有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))〇
[0034] 術語"適配體"意指一種經體外篩選技術得到的寡核苷酸序列（RNA或DNA)，與相 應的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力，大小一般約6-40kDa。
【附圖說明】
[0035] 圖1為基于適配體特異性識別目標分子的便攜式生物傳感器結合血糖儀檢測 AFBl的原理圖；
[0036] 圖2為血糖儀檢測緩沖液中AFBl以及血糖儀信號值與AFBl濃度的線性關系；
[0037] 圖3為血糖儀檢測不同類型的霉菌毒素；其中，對照組：沒有霉菌毒素；MIXl組： AFMp AFGp AFG2、AFB2、OTA 和 ZEA ;MIX2 組：AFMp AFGn AFG2、AFB1、AFB2、OTA 和 ZEA ;
[0038] 圖4為血糖儀檢測不同溫度下緩沖液中蔗糖酶的活性；
[0039] 圖5為血糖儀檢測不同孵育時間下緩沖液中的AFBl。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0041] 1、材料與儀器
[0042] Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)、Invertase (鹿糖酶）、 Tween-20 (吐溫-20)、Sucrose (鹿糖），來自 Sigma 公司；Amicon-3K、Amicon_100K，來自 Millipore 公司；sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxyl ate (sulfo-SMCC)，來自Thermofisher公司；鏈霉親和素修飾的磁球（直徑1 μπι)、磁分離 器，來自Bangs Laboratories, Inc.公司；黃曲霉毒素 BI (AFBl)標準品，來自國家標準物質 中心；血糖儀及試紙條，來自羅氏ACCU-CHEK Avia;超純水，來自Millipore Advantage AlO 純水系統；恒溫混勾儀，來自愛本德Thermomixer comfort型號；基因漩禍混勾器，來自IKA 品牌；落地高速冷凍離心機，來自HITACHI CR22G111型號；移液槍；微型離心機；水浴氮吹 儀；AFBl適配體和互補DNA，生工生物工程（上海）有限公司合成，（AFBl適配體和互補DNA 的修飾：對AFBl適配體3'端進行生物素修飾，互補DNA的3'端進行巰基修飾，采用高效 液相色譜法進行純化）。
[0043] 緩沖液A :0.1 M氯化鈉，0.1 M磷酸鈉 ，pH = 7. 3 ;
[0044] 緩沖液B :0· IM氯化鈉，0· IM磷酸鈉 ，pH = 7. 3,0· 05% (質量比）吐溫-20。
[0045] 2M蔗糖溶液用緩沖液A進行溶解，保存在4°C。
[0046] 實施例1適配體生物傳感器的合成以及結合血糖儀檢測黃曲霉毒素 Bl
[0047] 1、實驗方法
[0048] I. IDNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0049] I. I. 1蔗糖酶分子的活化
[0050] 取 400 μ I 20mg/ml 鹿糖酶（buffer B)與 Img sulfo-SMCC 混合，禍旋震蕩 5min， 放置恒溫混勻儀上，室溫反應2h。
[0051] I. I. 2DNA分子的活化
[0052] 取 100 μ 1 100 μΜ 互補 DNA(thiol-DNA，3' -SH-A12-CAACCCGTGCACA-5'），2 μ 1 0.1 M buffer Β，2 μ I 30mM TCEP(超純水）加入到1.5ml離心管中，渦旋混勻，放置恒溫混 勻儀上，室溫反應Ih (其中，①互補DNA的處理：將合成的固體DNA (4°C，12000rcf，5min)離 心，按要求加入345 μ 1超純水，輕微渦旋混勻，得到345 μ I 100 μ M的DNA溶液；②TCEP的 配制：TCEP分子量286. 65,稱量8. 59mg，溶于Iml的超純水，得到Iml 30mM TCEP溶液）。
[0053] I. I. 3DNA-蔗糖酶聚合物的合成
[0054] 將蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反應溶液離心（25°C、12000rcf、5min)，吸取上清 液，分別加入到超濾管中（鹿糖酶-SMCC用Amicon-IOOK ;thiol_DNA用Amicon_3K)，離心 (25°C、12000rcf、IOmin)，用buffer A洗滌8次；將8次離心洗滌后的thiol-DNA和蔗糖 酶-SMCC分別從超濾管中吸出，轉移到1.5ml的離心管中，渦旋混勻，室溫放置恒溫混勻儀 上反應48h。
[0055] I. 2DNA-鹿糖酶在磁球上的固定
[0056] I. 2. 1磁球和AFBl適配體的鏈接
[0057] 取Iml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球（MBs)放置磁分離器上至完全澄清，吸除上 清液，用 buffer B 洗滌 2 次；取 60 μ I (λ ImM AFBl 適配體（5' -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCT GTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3^ )(超純水）加入到磁球溶液中，輕微渦旋混 勻，放置恒溫混勻儀上，室溫反應lh，用buffer B洗滌3次。
[0058] I. 2. 2DNA-蔗糖酶的洗滌
[0059] 將 48h 反應后的 DNA-蔗糖酶用超過濾器 Amicon-IOOK (25°C、12000rcf、IOmin)離 心，用buffer A洗滌8次。
[0060] I. 2. 3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定
[0061 ] 將洗滌后的DNA-蔗糖酶溶液轉移到磁球-aptamer溶液中，渦旋混勻， 放置恒溫混勻儀上，室溫反應lh，用buffer B洗滌3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖 酶聚合物（Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成適配體生物傳感器系統。將合成的 Invertase-DNA-apt-MBs均勾分散在Iml buffer B中，每份取60 μ 1用于下一步的檢測。
[0062] 1. 3適配體生物傳感器結合血糖儀檢測緩沖液中的AFBl
[0063] 取 20μ1 不同濃度（0、0· 25、2、6· 25、12· 5、25、50、100、200、400 μΜ)的 AFBl (buffer Β)溶液加入到一份Invertase-DNA-apt-MBs溶液中（用磁分離器去除 buffer)，輕微禍旋混勾，充分反應30min((MBs的濃度約3mg/ml);將上述反應后的MBs溶 液，用磁分離器分離，吸取10 μ 1上清液，加入到5 μ 12M Sucrose (buffer B)離心管中，渦 旋混勻，室溫（25°C )反應30min ;取5 μ 1反應后溶液用血糖儀檢測。
[0064] 1. 4特異性分析
[0065] 為了評價所開發的適配體生物傳感器的選擇性，實驗選擇了一個對照組和6種霉 菌毒素（AFMpAFBrAFGpAFG 2WTA and ΖΕΑ)以及MIXl組和ΜΙΧ2組進行了檢測，其中，MIXl 組：AFMn AFGn AFG2、AFB2、OTA 和 ZEA ;MIX2 組：AFMp AFG0 AFG2、AFB1、AFB2、OTA 和 ZEA ;所 有實驗的霉菌毒素濃度為lppm。檢測步驟與上述緩沖液中AFBl的檢測步驟相同。
[0066] 1. 5數據分析
[0067] 實驗數據采用Excel進行標準化處理，圖表采用Adobe Illustrator CS5和 0rigin8. 0進行作圖分析。
[0068] 2、實驗結果
[0069] 2. 1適配體生物傳感器檢測原理
[0070] 便攜式生物傳感器檢測AFBl的原理如圖1所示。
[0071] 鏈霉親和素包被的磁球與