一種定量檢測黃曲霉毒素b1的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及定量檢測黃曲霉毒素 Bl的方法，尤其涉及一種適配體生物傳感器結 合血糖儀定量檢測黃曲霉毒素 Bl的方法，屬于黃曲霉毒素 Bl的定量檢測領域。
【背景技術】
[0002] 霉菌毒素（mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中產生的有毒代 謝產物，它們可通過飼料或食品進入人和動物體內，引起人和動物的急性或慢性毒性，損害 機體的肝臟、腎臟、神經組織、造血組織及皮膚組織等。常見的霉菌毒素有黃曲霉毒素、赭 曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏馬菌素等。黃曲霉毒素 Bl(AFBl)被世界衛生組織（WHO)國際癌癥研究機構認定為一級致癌物，開發高靈敏的黃曲 霉毒素檢測方法是國際關注的重點。
[0003] 適配體與抗體的性質相似，但適配體特異性更強，對目標靶分子具有更高的親和 力，更容易獲得，在體外可以大量快速的合成，制備方法也更為簡單，可以針對不同種類的 目標物進行篩選。血糖儀是一種測量血糖水平的電子儀器，由于其體積小，成本低，操作簡 單，能夠得到準確的定量結果，已經得到廣泛應用。然而，血糖儀只能檢測葡萄糖這一種物 質，并且檢測范圍是0. 6~33mmol/l (10~600mg/dl)。
[0004] 目前，黃曲霉毒素 Bl的很多檢測方法存在所需試劑多，操作繁瑣，檢測周期長，重 現性差，設備昂貴，前處理復雜等缺點，不利于進行現場檢測。因此，開發一種便攜式適配體 生物傳感器結合血糖儀定量檢測黃曲霉毒素 Bl這種非葡萄糖物質的方法，將具有廣泛的 應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種定量檢測黃曲霉毒素 Bl的方法，該方法 應用適配體生物傳感器結合血糖儀定量檢測黃曲霉毒素 B1，具有操作簡便，檢出限低，特異 性好，重復再現性好等優點。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0007] 本發明首先公開了黃曲霉毒素 Bl的適配體，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
[0008] 所述適配體的互補DNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、 SEQ ID Nd 9 或 SEQ ID Nd 10 所示。
[0009] 本發明進一步公開了一種定量檢測黃曲霉毒素 BI的方法，包括以下步驟：（1)制 備適配體生物傳感器；(2)提取待測樣品中的黃曲霉毒素 Bl，得到樣品提取液，加入到所述 適配體生物傳感器中，混勻，孵育；（3)分離上清液，加入過量蔗糖溶液進行反應；（4)用血 糖儀進行定量檢測。
[0010] 其中，步驟（1)所述適配體生物傳感器按照以下方法制備：（a)活化蔗糖酶；(b) 活化所述互補DNA ; (c)將步驟（a)活化后的蔗糖酶與步驟（b)活化后的互補DNA分別洗 滌，然后混勻，反應合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)將鏈霉親和素修飾的磁球鏈接所述黃曲霉 毒素 Bl的適配體；（e)將步驟（c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗滌后固定在步驟（d)處理 的磁球上，即得。
[0011] 步驟（b)所述互補DNA的3'端進行巰基修飾；步驟（d)所述黃曲霉毒素 Bl適配 體的3'端進行生物素修飾。
[0012] 步驟（a)所述活化鹿糖酶是將鹿糖酶與sulf〇-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)反應；其中，所述反應的體系包括： 300-500 μ I 20mg/ml蔗糖酶，0. 5-2mg sulfo-SMCC ;所述反應的條件為：先渦旋震蕩5min， 然后在恒溫混勻儀上室溫反應l-3h ;
[0013] 優選的，所述反應的體系包括：400 μ I 20mg/ml鹿糖酶，Img sulfo-SMCC ;所述反 應的條件為：先渦旋震蕩5min，然后在恒溫混勻儀上室溫反應2h。
[0014] 步驟（b)所述活化互補DNA是將所述互補DNA與TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)反應；其中，所述反應的體系包括：80_120μ1 100μΜ互補 DNA，1-3 μ 1 0.1 M緩沖液Β，1-3 μ I 30mM TCEP ;所述反應的條件為：恒溫混勻儀上室溫反 應 0· 5-2h ;
[0015] 優選的，所述反應的體系包括：100 μ 1 100 μM所述互補DNA，2 μ 1 0.1 M緩沖液B， 2 μ I 30mM TCEP ;所述反應的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應Ih ;所述緩沖液B包括：0.1 M 氯化鈉，0.1 M磷酸鈉，質量比為0.05 %的吐溫-20, pH = 7. 3。
[0016] 步驟（c)所述洗滌包括：將步驟（a)反應后的溶液離心，取上清液，加入到超濾管 Amicon-100K，25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌；將步驟（b)反應后的溶液離心， 取上清液，加入到超濾管Amicon-3K中，25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A洗滌；其中， 所述緩沖液A包括：0.1 M氯化鈉，0.1 M磷酸鈉 ，pH = 7. 3 ;步驟（c)所述反應合成DNA-蔗 糖酶聚合物的條件是恒溫混勻儀上室溫反應24-72h，優選為48h。
[0017] 步驟（d)所述鏈接的體系包括：0. 5_2ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球， 40-80 μ 1 0.1 mM所述黃曲霉毒素 Bl的適配體；所述鏈接的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應 0. 5-2h ；
[0018] 優選的，步驟（d)所述鏈接的體系包括：1ml lmg/ml鏈霉親和素修飾的磁球， 60 μ 1 0.1 mM所述黃曲霉毒素 Bl的適配體；所述鏈接的條件為：恒溫混勻儀上室溫反應 lh〇
[0019] 步驟（e)所述洗滌是將步驟（c)合成的DNA-鹿糖酶聚合物用超濾管Amicon-IOOK 于25°C、12000rcf離心10min，用緩沖液A (所述緩沖液A包括：0.1 M氯化鈉，0.1 M磷酸鈉， pH = 7. 3)洗滌；步驟（e)所述固定是將洗滌后的DNA-鹿糖酶聚合物與步驟（d)處理的 磁球混合，在恒溫混勻儀上室溫反應0. 5-2h，優選為lh。
[0020] 本發明定量檢測黃曲霉毒素 BI的方法中，步驟（2)將樣品提取液加入適配體生物 傳感器中，使適配體生物傳感器的終濃度為3mg/ml ;所述孵育的條件為：25°C孵育30min ; 步驟（3)所述反應的條件為：25°C反應30min ;所述分離上清液是將反應后的溶液用磁分離 器分離，然后吸取上清液；步驟（4)所述定量檢測是根據血糖儀的讀數與黃曲霉毒素 Bl標 準品的濃度作回歸方程，將待測樣品的血糖儀讀數帶入回歸方程，計算待測樣品中黃曲霉 毒素 Bl的濃度；其中，所述待測樣品包括食品。
[0021] 本發明針對黃曲霉毒素 BI分別合成了 5條適配體序列及不同適配體序列相對應 的互補DNA序列（適配體序列SEQ ID NO. 1，其對應的互補DNA核苷酸序列為SEQ ID NO. 6; 適配體序列SEQ ID NO. 2,其對應的互補DNA核苷酸序列為SEQ ID NO. 7;依此類推。）；其 中，SEQ ID NO. 5所示適配體序列與SEQ ID NO. 4所示序列的差異在于：SEQ ID NO. 5所示 序列后多加12個A堿基。
[0022] 本發明分別用不同的適配體序列及其互補DNA序列合成適配體生物傳感器，比較 不同適配體序列的血糖儀信號值。結果表明，當AFBl的濃度為25 μΜ，SEQ ID NO. 1-4所 示適配體序列所產生的血糖儀信號值分別為37mg/dl、35mg/dl、43mg/dl、53mg/dl ;SEQ ID NO. 5所示適配體序列加了 12個A堿基以后血糖儀的信號值為115mg/dl。可能是由于添加 12個A堿基以后，適配體序列的3'端與磁球結合，增大了適配體與磁球之間的空間位置，適 配體能更好的與AFBl分子結合，釋放下來更多的蔗糖酶分子，血糖儀的信號值明顯增加。 因此，本發明黃曲霉毒素 Bl適配體的核苷酸序列優選為SEQ ID NO. 5所示，其互補DNA的 核苷酸序列為SEQ ID NO. 10所示。
[0023] 本發明適配體生物傳感器結合血糖儀定量檢測食品中黃曲霉毒素 Bl的原理包 括，鏈霉親和素包被的磁球與生物素修飾的適配體相結合，蔗糖酶和互補DNA相結合；將 DNA-蔗糖酶聚合物通過互補DNA與適配體堿基互補配對的原則固定到磁球表面；當溶液中 含有所需檢測目標分子時，目標分子與適配體特異性結合，從而將DNA-蔗糖酶聚合物從磁 球上釋放到溶液中；用磁分離器分離溶液，釋放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能夠高效水 解蔗糖為葡萄糖，從而通過血糖儀進行定量檢測。由于被釋放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合 物的量能夠通過葡萄糖的量來表示，并且蔗糖酶的量與樣品中目標分子的量存在一定的比 例關系。因此，血糖儀的讀數能夠被用來定量目標分子的濃度。
[0024] 本發明適配體生物傳感器4°C條件下能有效保存7天。
[0025] 本發明對適配體生物傳感器檢測AFBl的過程中整個實驗溫度、生物傳感器與目 標分子的孵育時間進行了優化。結果表明，蔗糖酶的活性在25°C時實驗效果更好；目標物 和DNA-蔗糖酶固定的磁球孵育時間30分鐘，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶被釋放的更完 全。因此，本發明適配體生物傳感器檢測AFBl的過程中實驗溫度均為25°C，孵育時間為 30min〇
[0026] 本發明運用適配體生物傳感器結合血糖儀檢測緩沖液中不同濃度的AFB1，結果表 明隨著AFBl濃度的增加，血糖儀的信號值也在逐步增加。當AFBl的濃度在2. 5X KT8M~ 4. OX 10 6M范圍時，血糖儀的信號值有一個良好的線性關系。AFBl的最低檢測限是5. 9ng/ ml。歐洲食品安全局規定了 AFBl在食品中限量范圍是0~12.0yg/kg。中國現行的 GB2761-2011 "食品中黃曲霉毒素的限量標準"和其他標準規定在嬰幼兒谷類輔助食品中黃 曲霉毒素 Bl的限量標準是0. 5 μ g/kg，在玉米，花生及其制品中（花生油除外）黃曲霉毒素 Bl的限量是20 μ g/kg，在大米和食用油中限量是10 μ g/kg，在其他谷物、豆類、發酵食品中 限量是5 μ g/kg。因此，本發明方法的檢出限除嬰幼兒輔助食品以外基本能滿足檢測要求。
[0027] 重復實驗結果表明，本發明適配體