boratory Press:New York；F. M. Ausubel,R. Brent,R.E.Kingston, D. D. Moore,J.G.Seidman,J.A. Smith, K. Struhl(Hi). 1998.Current Protocols in Molecular Biology. Wiley:New York)實施。
[0106]實施例la:編碼雨牛紅球藻（H. pluvialis)胡蘿卜素輕仆，酉每LF的 pMB6486 (Hygrtef-crtZ-Hp~)
[0107] 如使用雨生紅球藻（UTEXNo. 2505)的mRNA序列分析的結果，發明人令人驚奇地 發現了新的胡蘿卜素羥化酶，將其命名為HpW-CrtZ(雨生紅球藻LF(低頻））羥化酶。
[0108] 使用如SEQIDN0:3中詳明的解脂耶氏酵母密碼子偏好，基于雨生紅球藻基 因的推導的蛋白序列從頭合成密碼子優化的胡蘿卜素羥化酶（HpHCrtZ)ORF序列。在 從頭合成的過程中，將包含Nhel限制位點和允許有效翻譯的典型Kozak序列的序列 5'-TGCTAGCCACAAAA添加至緊接ATG的上游。將包含Mlul限制位點的序列ACGCGT-3'添加 至緊接終止密碼子的下游。該序列使用Nhel和Mlul裂解并連接至用Nhel和Mlul剪切的 PMB6157以產生pMB6486。所得pMB6486編碼的HpLF-CrtZ蛋白詳明于SEQIDN0:2中。
[0109]實施例lb:編碼粉塵克羅諾桿菌（之前的粉塵腸桿菌）胡蘿卜素羥化酶的 DMB6056 (Hvg^tef-crtZ-ED)的產牛。
[0110]使用如SEQIDN0:4中詳明的解脂耶氏酵母密碼子偏好，基于粉塵克羅諾桿菌 (之前稱為粉塵腸桿菌（EMBL登錄號CAZ90621. 1))基因的推導的蛋白序列從頭合成密碼子 優化的胡蘿卜素羥化酶（Ep-CrtZ)ORF序列。在從頭合成的過程中，將包含Nhel限制位點 和允許有效翻譯的典型Kozak序列的序列5' -TGCTAGCCACAAAA添加至緊接ATG的上游。將 包含Mlul限制位點的序列ACGCGT-3'添加至緊接終止密碼子的下游。該序列使用Nhel和 Mlul裂解并連接至用Nhel和Mlul剪切的pMB6157以產生pMB6056。
[0111] 實施例lc :編碼黃桿菌屬R1534古月蘿卜素輕化酉每的dMB6487 (Hyg^tef-crtZ-Fb)的 產牛。
[0112] 使用解脂耶氏酵母密碼子偏好，基于如美國專利6, 087, 152中詳明的黃桿菌屬 R1534的蛋白序列從頭合成密碼子優化的胡蘿卜素羥化酶（Fb-CrtZ)。在從頭合成的過程 中，將包含Nhel限制位點和允許有效翻譯的典型Kozak序列的序列5' -TGCTAGCCACAAAA添 加至緊接ATG的上游。將包含Mlul限制位點的序列ACGCGT-3'添加至緊接終止密碼子的 下游。
[0113] 該序列使用Nhel和Mlul裂解并連接至用Nhel和Mlul剪切的pMB6157以產生 PMB6487。
[0114] 實施例2A :向解脂耶氏酵母角昔素產牛株ML6804引入三種胡蘿卜素羥化_基_ 以產牛蝦青素
[0115] 為測試Hp^CrtZ的輕化潛力并與FbCrtZ和EpCrtZ進行比較，用三種不同的構 建體轉化菌株ML6804。
[0116] 1)攜帶tef lp控制下的黃桿菌屬crtZ基因和潮霉素抗性標記Hyg1^ pMB6487的 Hindlll-Xbal片段；
[0117] 2)攜帶teflp控制下的粉塵克羅諾桿菌（之前為粉塵腸桿菌）crtZ基因和潮霉素 抗性標記Hygl^ pMB6056的PvuII片段；
[0118] 3)攜帶teflp控制下的雨生紅球藻"低頻"crtZ基因和潮霉素抗性標記Hyg1^ PMB6486的Hindlll-Xbal片段。
[0119] 在30°C生長3-4天后在具有100mg/L潮霉素的YPD上選擇轉化體。將來自每種 構建體的十個轉化體在搖瓶中的YPD內生長4天。全部轉化體產生蝦青素。來自每種轉 化的代表性轉化體與其親代菌株ML6804示于圖1。包含黃桿菌屬R1534crtZ基因的菌株 ML12471產生3%的蝦青素和9%的金盞花紅素（作為總類胡蘿卜素的百分比）。包含粉塵 克羅諾桿菌（之前為粉塵腸桿菌）(：竹2基因的菌株此11622產生7%的蝦青素和11%的金 盞花紅素。且包含雨生紅球藻wcrtZ基因的菌株ML12466產生12%的蝦青素和22%的金 蓋花紅素。
[0120] 實施例2B :向解脂耶氏酵母蝦青素產牛株引入雨牛紅球藻LF胡蘿卜素羥化酶以 增加蝦青素的純度
[0121] 用攜帶tefl啟動子、HpW crtZ基因和針對潮霉素抗性Hygl^選擇性標志的 PMB6486的Hindlll-Xbal片段轉化菌株ML9863和ML11956。在30°C生長3-4天后，在轉化 平板（YPD，具有100mg/L潮霉素）上選擇來自與親代相比表現較暗的每種株的二十個HygR 轉化體。轉化體在YH)中于搖床中生長4天。與其親代菌株相比兩個代表性的轉化體示于 圖2。
[0122] ML12562源自ML9863且ML12566源自ML11956。作為總類胡蘿卜素的百分比， ML12562和ML12566相比它們的親代分別產生3倍（40%對13% )和2倍（27%對13% ) 更多的蝦青素（圖2)。
[0123] 實施例2c :向解脂耶氏酵母β -胡蘿卜素產牛株引入雨牛紅球藻LF羥化酶以產 牛β-隱昔素：
[0124] 用三種不同的構建體轉化菌株ML5252 :
[0125] 1)攜帶teflp控制下的黃桿菌屬R1534crtZ基因和潮霉素抗性標記Hygl9 PMB6487的Hindlll - Xbal片段；
[0126] 2)攜帶teflp控制下的粉塵克羅諾桿菌（之前為粉塵腸桿菌）crtZ基因和潮霉素 抗性標記Hygl^ pMB6056的PvuII片段；
[0127] 3)攜帶teflp控制下的雨生紅球藻LF crtZ基因和潮霉素抗性標記Hygl9 PMB6486的Hindlll-Xbal片段。
[0128] 在30°C生長3-4天后在具有100mg/L潮霉素的YPD上選擇轉化體。將來自每種構 建體的十株轉化體在搖瓶中的Yro內生長4天。全部轉化體都產生玉米黃質和β-隱黃素。 代表性轉化體與親代菌株ML5252相比示于圖3。包含黃桿菌屬crtZ基因的菌株ML12458 產生6%的β-隱黃素和6%的玉米黃質（作為總類胡蘿卜素的百分比）。包含粉塵克羅諾 桿菌（之前為粉塵腸桿菌）crtZ基因的菌株ML10341產生3%的β-隱黃素和39%的玉米 黃質（作為總類胡蘿卜素的百分比）。包含雨生紅球藻LFcrtZ基因的菌株ML12453產生 21%的β-隱黃素和4%的玉米黃質（作為總類胡蘿卜素的百分比）。
[0129] 從解脂耶氏酵母細朐提取類胡蘿卜素并通討HPLC宙量類胡蘿卜素牛產:
[0130] 根據之前美國專利號7, 851，199Β2中描述的方法對生成的菌株實施搖瓶測試和 類胡蘿卜素分析。
【主權項】
1. 一種用于類異戊二烯的微生物羥化的具有羥化酶活性的多肽，其選自下組： a) SEQIDNO: 2 的多肽； b) 源自SEQIDNO:2通過氨基酸的取代、插入或缺失并與SEQIDNO:2的序列在氨基 酸水平具有至少50%同源性的多肽。2. 權利要求1的多肽，其中所述蛋白具有用于將胡蘿卜素轉變成隱黃素和/ 或玉米黃質的酶活性，和/或將角黃素轉變成andirubin和/或蝦青素的酶活性。3. -種編碼權利要求1的多肽的分離的核酸。4. 權利要求3的分離的核酸，其分別由SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 3描述的序列組成。5. -種核酸構建體或表達載體，其包含與一個或多個（幾個）調控序列可操作連接的 權利要求3或4的多核苷酸，所述調控序列指導所述多肽在表達宿主細胞中的產生。6. -種轉化的微生物（宿主細胞），其中表達權利要求3或4的核酸。7. 權利要求6的轉化的微生物，其類胡蘿卜素代謝不同于野生型。8. 權利要求7的轉化的微生物，其中所述微生物是含油株（oleaginousstrain)。9. 權利要求8的轉化的微生物，其中所述含油株是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)的菌株。10. -種用于產生權利要求6的轉化的微生物的方法，其包括引入由SEQIDNO: 1中描 述的序列組成的核酸或核酸構建體，其與一個或多個調節信號功能性連接。11. 一種用于制備類胡蘿卜素或類胡蘿卜素衍生物的方法，其包括在權利要求1的多 肽存在下將β-紫羅蘭酮轉變成3-羥基-β-紫羅蘭酮和/或將4-酮-β-紫羅蘭酮轉變 成3-羥基-4-酮-β-紫羅蘭酮結構元件。12. 權利要求11的方法，包括如下步驟： a) 在有助于類胡蘿卜素產生的條件下培養根據權利要求6至9中任一項的轉化的微生 物；和 b) 回收所述類胡蘿卜素和類胡蘿卜素衍生物。13. -種包含權利要求1或2任一項的多肽的組合物。
【專利摘要】本發明涉及新的羥化酶、編碼它的核酸序列、包含此序列的表達構建體和載體、用其轉化的微生物和用于類異戊二烯的微生物羥化的方法，例如，用于將β-胡蘿卜素轉變成β-隱黃素和玉米黃質、將角黃素轉變成蝦青素的方法。
【IPC分類】C12N9/02, C12P23/00
【公開號】CN105308180
【申請號】CN201380066965
【發明人】C·法雷爾, M·馬約爾加, B·謝弗勒
【申請人】帝斯曼知識產權資產管理有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2013年8月27日
【公告號】CA2895298A1, EP2935570A1, US20150315550, WO2014096990A1, WO2014096990A8