如，電穿孔、與裝載的泡融合 或用多種堿金屬或堿土金屬鹽如鋰、銣或鈣鹽脫穩定化，鋰鹽為優選的。
[0088] 本發明進一步涉及相應的遺傳修飾的生物，當初始生物包含胡蘿卜素羥化酶基因 的情況下，其通過遺傳修飾而使根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因的表達與野生型生物相 比增加；或在初始生物不包含胡蘿卜素羥化酶基因的情況下，其通過遺傳修飾引起根據本 發明的胡蘿卜素羥化酶基因的表達。
[0089] 遺傳修飾的生物意指生物，其中（優選通過上述方法之一）已插入根據本發明的 胡蘿卜素羥化酶基因或核酸構建體。
[0090] 遺傳修飾的生物包含至少一種根據本發明的胡蘿卜素羥化酶基因或至少一種根 據本發明的核酸構建體。取決于初始生物，所述核酸可存在于染色體內或染色體外。
[0091] 與野生型相比優選地改變遺傳修飾的生物中的類胡蘿卜素代謝。
[0092] 優選的生物為重組真菌或酵母。在一個具體的實施方案中，所述重組真菌是含油 的（oleaginous)，因為它可將脂質積累至其干細胞重量的至少約20% ;并產生至少一種 選自下組的類胡蘿卜素：表氧化玉米黃質（antheraxanthin)、金盞花紅素（adonirubin)、 側金盞花黃質（adonixanthin)、蟲下青素（astaxanthin)、角黃素（canthaxanthin)、 capsorubrin、β-隱黃素（β-cryptoxanthin)、α-胡蘿卜素（a-carotene)、β、Φ-胡 蘿卜素、胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素、海膽酮、3-羥基海膽酮、3'-羥基海膽酮、γ-胡蘿卜 素、4-酮-γ-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、α-隱黃素、脫氧屈曲黃素（deoxyflexixanthin)、 娃藻黃質（diatoxanthin)、7, 8-二脫氫?!下青素、二脫氫番前紅素（didehydrolycopene)、 巖藻黃素（fucoxanthin)、巖藻黃醇（fucoxanthinol)、異胡蘿卜素（isorenieratene)、 異胡蘿卜素、山萬苣黃素（lactucaxanthin)、葉黃素（lutein)、番前紅素（lycopene)、 myxobactone、新黃質（neoxanthin)、鏈孢紅素（neurosporene)、羥基鏈孢紅素、多甲藻素 (peridinin)、八氫番前紅素（phytoene)、視紫紅質（rhodopin)、視紫紅質葡糖苷、4-酮玉 紅黃質（4-ketorubixanthin)、管藻黃質（siphonaxanthin)、球形稀（spheroidene)、球 形酮（spheroidenone)、螺菌黃質（spirilloxanthin)、紅酵母稀（torulene)、4_ 酮-紅酵 母稀、3-羥基-4-酮-紅酵母稀、尿酸酯（uriolide)、尿酸醋酸酯（uriolideacetate)、 紫黃質（violaxanthin)、玉米黃質-β-二葡糖苷、玉米黃質、C30類胡蘿卜素及其組 合，且可將產生的類胡蘿卜素積累至其干細胞重量的至少約1%。甚至更優選地，重組 真菌是選自下組的屬的成員：曲霉屬（Aspergillus)、布拉霉屬（Blakeslea)、葡萄孢屬 (Botrytis)、假絲酵母屬（Candida)、尾孢屬（Cercospora)、隱球菌屬（Cryptococcus)、 小克銀漢霉屬（Cunninghamella)、鐮孢屬（Fusarium)(赤霉屬（Gibberella))、克魯維 酵母屬（Kluyveromyces)、油脂酵母屬（Lipomyces)、被孢霉屬（Mortierella)、毛霉屬 (Mucor)、脈抱菌屬（Neurospora)，青霉屬（Penicillium)、須霉屬（Phycomyces)、畢赤酵 母屬（Pichia)(漢遜酵母屬（Hansenula))、柄銹菌屬（Puccinia)、腐霉屬（Pythium)、 紅冬抱酵母屬（Rhodosporidium)、紅酵母屬（Rhodotorula)、酵母屬（Saccharomyces)、 小核菌屬（Sclerotium)、木霉屬（Trichoderma)、絲抱酵母屬（Trichosporon)、 Xanthophyllomyces(發夫酵母屬（Phaffia))和耶氏酵母/西洋蓍霉屬（Yarrowia)或為 選自下組的菌種：土曲霉（Aspergillusterreus)、構巢曲霉（Aspergillusnidulans)、 黑曲霉（Aspergillusniger)、三抱布拉霉（Blakesleatrispora)、灰葡萄抱（Botrytis cinerea)、日本假絲酵母（Candida japonica)、鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima)、 拉考夫假絲酵母（Candida revkaufi)、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis)、產朊假絲 酉孝母（Candidautilis)、煙草尾抱（Cercosporanicotianae)、Cryptococcuscurvatus、 刺抱小克銀漢霉（Cunninghamellaechinulata)、秀剛小克銀漢霉（Cunninghamella elegans)、藤倉鐮孢（Fusariumfujikuroi)(玉米赤霉（Gibberellazeae))、乳酸克魯 維酵母（Kluyveromyceslactis)、斯達氏油脂酵母（Lipomycesstarkeyi)、Lipomyces lipoferus、高山被抱霉（Mortierellaalpina)、拉曼被抱霉（Mortierellaramanniana)、 深黃被抱霉（Mortierellaisabellina)、葡酒色被抱霉（Mortierellavinacea)、卷 枝毛霉（Mucorcircinelloides)、粗糙脈孢霉（Neurosporacrassa)、布拉克須霉 (Phycomycesblakesleanus)、巴其萬德畢赤酉孝母（Pichiapastoris)、Pucciniadistincta、 畸雌腐霉（Pythiumirregulare)、對圓紅冬抱酵母（Rhodosporidiumtoruloides)、 膠紅酵母（Rhodotorulaglutinis)、禾本紅酵母（Rhodotorulagraminis)、粘質紅酵 母（Rhodotorulamucilaginosa)、Rhodotorulapinicola、纖細紅酵母（Rhodotorula gracilis)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、齊整小核菌（Sclerotiumrolfsii)、 里氏木霉（Trichodermareesei)、皮膚絲抱酵母（Trichosporoncutaneum)、范芽絲抱酵 母（Trichosporonpullulans)、Xanthophyllomycesdendrorhous(紅發夫酉孝母（Phaffia rhodozyma))和解脂耶氏酵母/解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)。
[0093] 在這些天然的含油株中，一些還天然地產生類胡蘿卜素而一些則不產生，這些株 可通過引入如美國專利7851199中公開的類胡蘿卜素生物合成基因被額外地用作宿主細 胞。
[0094] 在其他實施方案中，本發明提供產生類胡蘿卜素的方法，所述方法包括在允許類 胡蘿卜素產生的條件下培養真菌并分離產生的類胡蘿卜素的步驟。
[0095] 根據本發明遺傳修飾的微生物的培養以本身已知的方式發生，如適當的野生型的 培養，例如在合適的培養基中（如例如，在瓊脂平板上或在懸浮培養物中）的微生物的情 況，或在土壤或合適的營養培養基中的植物的情況。收獲意指在微生物的情況中微生物的 分離，和在植物的情況中植物（適當時，包含類胡蘿卜素的特定的植物部分）的切斷。類胡 蘿卜素以本身已知的方式分離，例如，通過生物細胞的破壞，類胡蘿卜素的提取，和通過化 學或物理分離方法如提取或層析對類胡蘿卜素的隨后的純化。
[0096] 下列實施例對本發明進行了闡述。 實施例
[0097] 下列表1描述某些在下列例示中使用的解脂耶氏酵母菌株：
[0098] 表1:解脂耶氏酵母菌株
[0099]
[0101] 以如美國專利7,851，199所述的ML350和ATCC201249開始，通過引入在內源 TEF1啟動子控制下的異源基因，加上數代雜交構建了耶氏酵母株ML5252、ML6804、ML9863 和ML9335。GGS基因和截短的HMG基因（"HMG-tr")分別源自對應天然的香葉基香葉基 焦磷酸合酶（geranylgeranylpyrophosphatesynthase)和輕甲基戊二酰輔酶A還原酶 (hydroxymethylglutaryl-CoAreductase)基因的耶氏酵母屬序列。carRP和carB基因 源自卷枝毛霉，且它們分別編碼雙功能性八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環化酶和八氫番 前紅素脫氫酶。合成crtW基因以編碼Parvularculabermudensis的胡蘿卜素酮酶（US 2012/0156718)。
[0102] 從自養黃桿菌（Xanthobacterautotrophicus) (Xa)擴增crtZ基因或進行合成以 編碼粉塵腸桿菌（Ep)(SEQIDN0:4)、腸桿菌科細菌DC404(Dc)(SEQIDN0:5)或黃桿菌屬 菌種R1534(Fb)(美國專利6, 087, 152)的胡蘿卜素羥化酶。這些基因有時但不總是與營養 缺陷標志（URA3、LEU2、URA2、LYS1、ADE1)或ΙοχΡ位點、HygR (潮霉素抗性）或NATR (諾爾 絲菌素抗性）標志的殘留相關。
[0103] 表2:質粒
[0104]
[0105] 本文描述的所有基礎分子生物學和DNA操縱方法基本上根據Sambrook等或 Ausubel等(J.Sambrook,E.F. Fritsch,T.Maniatis(編).1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor La