胡蘿卜素羥化酶及其用于產生類胡蘿卜素的用圖
【專利說明】胡蘿卜素羥化酶及其用于產生類胡蘿卜素的用途
[0001] 發明背景
[0002] 本發明涉及新的羥化酶、編碼它的核酸序列、包含此序列的表達構建體和載體、用 其轉化的微生物、用于類異戊二烯的微生物羥化的方法，例如，用于將胡蘿卜素轉變成 β-隱黃素或玉米黃質以及將角黃素轉變成蝦青素的方法。
[0003] 類胡蘿卜素是顏色在黃色至紅色范圍內的有機色素，其由一些生物包括光合生物 (例如，植物、藻類、藍藻）和一些真菌天然產生。
[0004] 類胡蘿卜素如葉黃素、玉米黃質或蝦青素是在人和牲畜飲食中作為色素物質和維 生素Α衍生物的前體的非常重要的添加劑。此外，類胡蘿卜素具有促進健康的作用如增強 免疫應答，而且由于其抗氧化劑特性的原因具有預防癌癥的作用，這使其用作感興趣的保 健品（nutraceutical)。因此用于制備類胡蘿卜素的經濟方法和具有增加的類胡蘿卜素含 量的食品至關重要。用于制備類胡蘿卜素的特別經濟的方法是生物技術方法，其利用來自 產生類胡蘿卜素的生物的類胡蘿卜素生物合成的生物合成基因和蛋白。
[0005] 經由β-隱黃素催化β-胡蘿卜素酶法轉變成玉米黃質的原核β-胡蘿卜素羥化 酶和編碼這些蛋白的基因已知來自夏孢歐文氏菌（Erwiniauredovora) (Misawa等，J.of Bacteriology1990, 6704-6712;EP393690B1)、草生歐文氏菌（Erwiniaherbicola)(TO 9113078)、澄黃土壤桿菌（Agrobacteriumaurantiacum)(Misawa等，J.ofBacteriology 1995,6575-6584;EP735 137Al)、產堿菌屬菌種（Alcaligenessp.)PC-l(EP735 137Al)、黃桿菌屬菌種（Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes等，Gene 1997,185,35-41;EP747483A2)和來自藍藻集胞藻屬（CyanobacteriumSynechocystis) PCC6803(Masamoto等，PlantCellPhysiol. 1998, 39 (5)，560-564) 〇
[0006] 還已知來自橙黃土壤桿菌、產堿菌屬和噬夏孢歐文氏菌的原核胡蘿卜素 輕化酶還能夠將角黃素經由金蓋花紅素（adonirubin)轉變成4下青素（Misawa等，J.of Bacteriology1995, 6575-6584;Fraser等，J.Biol.Chem. 1997, 272, 6128-6135) 〇
[0007] 已知來自真核來源的三種植物β-胡蘿卜素羥化酶可催化β-胡蘿卜素經由 β-隱黃素酶法轉變成玉米黃質。相應的cDNA已從擬南芥（Arabidopsisthaliana) (Cunningham等，J.Biol.Chem. 1996, 271，24349-24352,TO9736998)和辣椒（Capsicum annuumL.)中分離。
[0008] 真核來源的基因相對于原核基因具有優勢，其在更高等的轉基因生物如植物中表 達更佳。盡管如此，仍然需要改進和增加類胡蘿卜素生產力用于通過將真核核酸并入生物 體而制備類胡蘿卜素衍生物或具有增加的類胡蘿卜素含量的食品的方法。
[0009] 此外，現有技術中適當的真核β-胡蘿卜素羥化酶具有它們僅有窄的底物范圍的 缺點使得存在不能由羥化酶轉變且可對羥化酶發揮抑制效果的代謝產物的積累。
[0010] 發明概沐
[0011] 本發明的目標之一是改正現有技術的所述缺陷并提供具有改進特性的真核胡蘿 卜素羥化酶。
[0012] 發明人發現通過包含氨基酸序列SEQIDΝ0:2的具有羥化類異戊二烯（例如， β-胡蘿卜素或角黃素）酶活性的蛋白可令人驚訝地實現上述目標。
[0013] 因此，本發明涉及包含氨基酸序列SEQIDΝ0:2的蛋白或多肽，或源自此序列通過 氨基酸的取代、插入或缺失并與序列SEQIDN0:2在氨基酸水平具有至少50%同源性的序 列。
[0014] 特別地，根據本發明的羥化酶如果在所選的或能夠產生特定類胡蘿卜素（例如玉 米黃質或蝦青素）的菌株中表達，與未用編碼根據本發明的蛋白或多肽的基因轉化的菌株 相比，可增加這些類胡蘿卜素的水平。
[0015] 本發明還涉及編碼本發明的多肽的分離的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸構 建體、重組表達載體和重組宿主細胞，并涉及產生所述多肽的方法。
[0016] 本發明還提供用于類胡蘿卜素生物產生的改進系統。在一個優選的實例中，本發 明提供產生一種或多種類胡蘿卜素的含油真菌（包括，例如，酵母）。本發明還提供構建所 述酵母和真菌的方法，使用這種酵母和真菌以產生類胡蘿卜素的方法，和制備包含類胡蘿 卜素的組合物（如食品或飼料添加劑，或營養補充劑）的方法，使用所述含油酵母或真菌中 產生的類胡蘿卜素的方法。特別地，本發明提供用于生成包含編碼本發明多肽的多核苷酸 的酵母和真菌的系統和方法。
[0017]序列表概沐
[0018] SEQIDNO: 1是編碼來自雨生紅球藻（Haematococcuspluvialis)的低頻胡蘿卜 素羥化酶的未優化DNA序列。
[0019] SEQIDN0:2是從SEQIDNO: 1推導的氨基酸序列。
[0020] SEQIDN0:3是編碼來自雨生紅球藻的低頻胡蘿卜素羥化酶的DNA序列，如對于在 解脂耶氏酵母/解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)中表達而優化的。
[0021] SEQIDN0:4是編碼來自粉塵克羅諾桿菌（Cronobacterpulveris)(之前為粉塵 腸桿菌（Enterobacterpulveris)(Ep)的胡蘿卜素輕化酶的DNA序列，如對于在解脂耶氏 酵母中表達而優化的。
[0022] SEQIDN0:5是編碼來自腸桿菌科（Enterobacteriaceae)細菌DC404(Dc)的胡蘿 卜素羥化酶的DNA序列，如對于在解脂耶氏酵母中表達而優化的。
[0023]
[0024] 分離的多肽：術語"分離的多肽"意指相對于天然發現的多肽由人工進行修飾的多 肽。在一個方面中，所述多肽為至少1 %純，例如，至少5%純、至少10%純、至少20%純、至 少40 %純、至少60 %純、至少80 %純，和至少90 %純，如通過SDS-PAGE確定的。
[0025] 基本上純的多肽：術語"基本上純的多肽"意指制備物，其包含按重量計至多 10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1 %和至多0. 5%的 與所述制備物天然或重組結合的其他多肽材料。優選地，所述多肽按制備物中存在的全部 多肽材料的重量計為至少92%純，例如，至少94%純、至少95%純、至少96%純、至少97% 純、至少98%純、至少99%純、至少99. 5%純，和100%純。本發明的多肽優選為基本上純 的形式。這可例如通過由已知的重組方法或由經典的純化方法制備多肽來實現。
[0026] 序列同一性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性通過參數"序 列同一"性"描述。
[0027] 就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性的程度使用如在EMBOSS包 (EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,Trends Genet. 2000, 16:276-277)的Needle程序，優選3.(λ0或以后的版本中執行的 Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970,J.Mol.Biol. 48:443-453)來確定。使 用的任項參數為缺口開放罰分10、缺口延伸罰分〇. 5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩陣。使用標記"最長同一性"的Needle輸出（使用-nobrief選項獲得）作為 百分比同一性并計算如下：
[0028](相同的殘基xlOOV(比對長度-比對中缺口的總數）
[0029] 就本發明而言，兩個脫氧核糖核酸序列之間的序列同一性的程度使用如在EMBOSS 包（EMB0SS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上 文）的Needle程序，優選3. 0. 0或以后的版本中執行的Needleman-Wunsch算法（Needleman 和Wunsch，1970,見上文）來確定。使用的任選參數為缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5 和EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。使用標記"最長同一性"的Needle 輸出（使用-nobrief選項獲得）作為百分比同一性并計算如下：
[0030](相同的脫氧核糖核酸xlOOV(比對長度-比對中缺口的總數）
[0031] 片段：術語"片段"意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個（幾 個）氨基酸的多肽，其中所述片段具有羥化酶活性。
[0032] 等位變體：術語"等位變體"意指占據相同染色體基因座的基因的兩種或多種可替 換形式中的任何。等位變異通過突變自然出現，且可導致種群內的多態性。基因突變可為 沉默的（在編碼的多肽中無變化）或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變 體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0033] 分離的多核苷酸：術語"分離的多核苷酸"意指相對于天然發現的多核苷酸由人 工進行修飾的多核苷酸。在一個方面中，所述分離的多核苷酸為至少1%純，例如，至少5% 純、至少10%純、至少20 %純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90 %純和至少 95 %純，如通過瓊脂糖凝膠電泳確定的。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合 成來源的，或其任何組合。
[0034] 基本上純的多核苷酸：術語"基本