為：蛋白腺15g/ 以玉米漿15g/l，葡萄糖15g/l，黃豆粉4g/l，氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，pH7.2， 搖床轉速為280r/min，29°C培養7化后種入發酵培養基，搖床轉速為280r/min，29°C培養 4化后，補入維生素化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止 發酵，測定發酵效價，與出發菌株相比，自養假諾卡氏菌突變株相對效價分布情況見表3,挑 選出發酵效價較高的菌株20支進行復篩。
[0040] 表3自養假諾卡氏菌突變株相對效價分布
從表3可知，采用該模型進行篩選，獲得自養假諾卡氏菌正突變的比例較高，達到 33. 3% 復篩：將挑選出的效價較高的20支菌株接種到種子培養基，搖床轉速為280r/min， 29°C培養7化后種入發酵培養基中，搖床轉速為280r/min，29°C培養4化后，補入維生素 化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止發酵，測定發酵效 價，挑選出效價最高的菌株1支，保存，備用。
[0041] 發酵培養基試驗：將效價最高的菌株進行發酵培養基試驗。按如下配方配制種子 培養基100mL:蛋白腺15g/L玉米漿15g/L葡萄糖15g/L黃豆粉4g/L氯化鋼5g/ L憐酸二氨鐘2g/L，pH7. 2。將種子培養基裝入3個250mlS角瓶中，每瓶30ml。滅菌后， 從斜面菌株挖塊接入種子培養基中，29°C培養72h，將種子液分別接入含有不同濃度聚山梨 醋-80的發酵培養基中進行發酵試驗，接種量為10% (V/V)。
[0042] 按照如下配方配制發酵培養基：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15旨/1，黃 豆粉4g/l，氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，倍他環糊精3邑/1，聚山梨醋-80 1.0、2.0、 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0g/L，抑7. 2。搖床轉速為 280r/min，29°C培養 4她后，補 入維生素化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養3天，停止發酵，測 定發酵效價，所對應的測定結果見表4。
[0043]HPLC方法：色譜柱為Kromasil正相硅膠柱（250X4. 6mmi.d，5um)，流動相為異丙 醇-正己燒（1 : 9)，流速1.5ml/min，柱溫為40°C，檢測波長265皿。
[0044] 對含有不同聚山梨醋-80濃度的培養基進行綜合比較，篩選出最佳發酵配方。
[0045] 表4實驗測定結果
從表4中可W看出，配方中聚山梨醋-80的濃度在3-8g/L時，25徑基維生素化的效價 較高，7g/L時25徑基維生素化效價最高。
【主權項】
1. 篩選25羥基維生素D3高產菌株的方法，包括如下步驟： (1) 初篩：將誘變處理的自養假諾卡氏菌單孢子懸浮液稀釋后涂布于含有聚山梨 酯-80含量為15-20g/L的分離培養基做成的若干平板上，在29°C培養箱中培養144-192h， 從若干平板中挑選生長和產孢良好的菌株接種于斜面培養基制成的若干斜面上，在29°C 培養箱中培養168h，斜面成熟后挖塊種入三角瓶中的種子培養基中，同時將用于誘變處理 的出發菌株斜面也挖塊種入三角瓶中的種子培養基中，作為對照，搖床轉速為280r/min， 29°C培養72h后，種入發酵培養基，將三角瓶置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養 48h后，補入維生素D3，使得維生素％在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止 發酵，測定兩種菌的發酵效價，與出發菌株相比，選出自養假諾卡氏菌突變株相對發酵效價 較高的菌株若干支進行復篩， (2) 復篩：將發酵效價較高的若干菌株接種于若干三角瓶中的種子培養基中，將三角瓶 置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養72h后接種于若干個三角瓶中的發酵培養 基中，將三角瓶置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養48h后，補入維生素D3，使得 維生素％在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止發酵，測定若干個三角瓶中 的發酵培養基發酵效價，挑選出一個三角瓶中發酵效價最高的一支菌株為最終產品。 2. 25羥基維生素D3高產菌株生產25羥基維生素D3的發酵培養基中聚山梨酯-80含量 的篩選方法，其特征在于將種子培養基裝入3個250ml三角瓶中，每瓶30ml，滅菌后，從25 羥基維生素D3高產菌株的斜面挖塊接入3個三角瓶種子培養基中，將三角瓶置于搖床上， 搖床轉速為280r/min，29°C培養72h，將3個三角瓶中的種子液分別移入含有不同含量聚 山梨酯-80的若干個三角瓶中的發酵培養基中進行發酵試驗，將三角瓶置于搖床上，搖床 轉速為280r/min，29°C培養48h后，補入維生素D3，使得維生素03在發酵液中的終濃度為 500ug/ml，繼續培養3天，停止發酵，測定發酵效價，確定一個三角瓶中的發酵效價最高的 發酵培養基，其聚山梨酯-80的含量為最佳值。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（1)中所述分離培養基成分和 含量為：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿3 g/L，氯化鈉4 g/L，瓊脂15 g/L，聚山梨 酯-80 15 g/L，ρΗ7·0。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（1)中所述斜面培養基成分和 含量為：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿3 g/L，氯化鈉4 g/L，瓊脂15 g/L，ρΗ7.0。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的種子培養基成分和含量為：蛋 白胨15 g/L，玉米漿15 g/L，葡萄糖15 g/L，黃豆粉4 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/ L，ρΗ7· 2〇6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的含聚山梨酯-80量不同的發酵 培養基，聚山梨酯-80含量分別為1-9 g/L中之一，其他成分和含量均為：蛋白胨15 g/L， 玉米漿15 g/L，葡萄糖15 g/L，黃豆粉4 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，倍他環糊精 3 g/L, pH7. 2〇7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述誘變處理為將出發菌株自 養假諾卡氏菌成熟斜面用生理鹽水制成單孢子懸液，經振蕩，玻璃珠分散30min，無菌過濾 收集單孢子懸液約l〇ml于無菌培養皿中，使其孢子的終濃度達到120-130個/ml，紫外功率 30W，燈距25cm照射30s〇8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述誘變處理為將出發菌株 自養假諾卡氏菌成熟斜面用pH7. 0的磷酸鈉緩沖液成單孢子懸液，經振蕩，玻璃珠分散 30min，無菌過濾收集單孢子懸液約10ml，使其孢子的終濃度達到120-130個/ml，加入烷 化劑甲基磺酸乙酯EMS，終濃度為3%，振蕩處理30min，加入硫代硫酸鈉終止反應，振蕩 20min〇9. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于發酵培養基中聚山梨酯-80的含量為3 -8 g/L〇
【專利摘要】本發明為篩選25羥基維生素D3高產菌株和發酵培養基中聚山梨酯-80含量的方法，解決誘變育種正突變率低，篩選工作量大，費時費力，從而不易篩選到高產菌株的問題。將能夠改變25羥基維生素D3產生菌自養假諾卡氏菌細胞膜通透性的物質聚山梨酯-80加入到分離培養基中，觀察菌株對聚山梨酯-80的耐受情況，確定其最低耐受劑量，選用出發菌株在高濃度下不能生長的聚山梨酯-80的量，作為篩選模型。經過誘變后的自養假諾卡氏菌菌種，用所建立的篩選模型進行篩選。
【IPC分類】C12N15/01, C12R1/01, C12P7/02
【公開號】CN105296464
【申請號】CN201510825931
【發明人】曾志剛, 梁彥明
【申請人】曾志剛, 梁彥明
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月25日