，來改變細胞膜通透性。本發明中，將表面活性劑聚山梨醋-80加入到分離培養基中 進行篩選發現：能耐受聚山梨醋-80的25徑基維生素化產生菌自養假諾卡氏菌突變株其 產生正突變株的幾率最高。因此選用聚山梨醋-80作為篩選模型來進行25徑基維生素 產生菌自養假諾卡氏菌高產菌株的篩選。
[0020] 觀察25徑基維生素化產生菌自養假諾卡氏菌菌株對聚山梨醋-80的耐受情況，W 平板上有無菌落生長為判定標準，確定其最低耐受劑量。其耐受劑量的確定采用如下方法： 將經過誘變后的25徑基維生素化產生菌自養假諾卡氏菌單抱子懸液經稀釋后分別涂布在 含有不同濃度聚山梨醋-80的分離培養基上進行培養，出發菌株作為對照品同時培養。觀 察不同濃度平板上菌落的生長情況，如果某個濃度的平板上無菌落生長，就可確定該濃度 為聚山梨醋-80的最低抑制濃度。選用出發菌株25徑基維生素化產生菌自養假諾卡氏菌 在高濃度下不能生長的聚山梨醋-80,作為篩選模型。
[0021] 本發明就是基于W上的原理而進行試驗；將能夠改變25徑基維生素產生菌自 養假諾卡氏菌細胞膜通透性的物質聚山梨醋-80加入到分離培養基中，觀察菌株對聚山 梨醋-80的耐受情況，確定其最低耐受劑量，選用出發菌株在高濃度下不能生長的聚山梨 醋-80的量，作為篩選模型。經過誘變后的自養假諾卡氏菌菌種，用所建立的篩選模型進行 篩選，對出發菌株因不能耐受高濃度聚山梨醋-80而生長的模型，如果在誘變后能生長，說 明自養假諾卡氏菌突變株對運種濃度的聚山梨醋-80能耐受，自養假諾卡氏菌突變株就能 適應細胞膜通透性更大的改變，就有可能篩選得到25徑基維生素化高產的自養假諾卡氏 菌突變株。
[0022] 本發明提供了一種培養基原料來源廣，成本低，出發菌株正突變株的幾率高、突變 株25徑基維生素化效價高的聚山梨醋-80耐受性模型篩選25徑基維生素D3高產菌株的 方法。
[0023] 本發明提供的25徑基維生素化高產菌株生產25徑基維生素D3的發酵培養基的 25徑基維生素化發酵效價高。
[0024] 本發明具有W下有益效果： 所提供的篩選方法操作簡便易行，所設及的培養基原料來源廣，成本低，非常適合工 業生產的需要；在本發明中能有效地提高獲得自養假諾卡氏菌正突變株的幾率，自養假諾 卡氏菌正突變株的25徑基維生素化發酵效價高，本發明為25徑基維生素D3發酵生產提供 高產自養假諾卡氏菌菌株和25徑基維生素化發酵效價高的發酵培養基，從而提高25徑基 維生素化發酵生產水平。
[00巧]【具體實施方式】： 實施例1: 誘變：將自養假諾卡氏菌（Pseudonocardiaautotrophica)單抱子懸液通過UV誘變： 將出發菌株成熟斜面用生理鹽水制成單抱子懸液，經振蕩，玻璃珠分散，無菌過濾收集單 抱子懸液，于無菌培養皿中，紫外光照射30s，紫外燈功率30W，燈距25-30cm; 初篩：按照如下配方配制分離培養基化：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l，玉米漿3g/l， 氯化鋼4g/L，瓊脂15g/L，聚山梨醋-80 15g/L，抑7.0。準備無菌培養皿100個，培養基 滅菌后倒入培養皿中做成平板。
[0026] 將誘變處理后的單抱子懸浮液Iml稀釋后涂布于平板上，29°C培養箱中培養 144h〇
[0027] 按照如下配方配制斜面培養基1.化：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l，玉米漿3g/ L，氯化鋼4g/L，瓊脂15g/L，PH7.0。準備試管120支，制成斜面備用。
[0028] 在含有高濃度聚山梨醋-80平板中挑選生長和產抱良好的菌株接種于斜面上，在 29 °C培養箱中培養16化。斜面成熟后挖塊種入種子培養基中，同時將用于誘變處理的出發 菌株斜面也挖塊種入種子培養基中，作為對照，種子培養基成分和含量為：蛋白腺15g/l， 玉米漿15g/L，葡萄糖15g/L，黃豆粉4g/L，氯化鋼5g/L，憐酸二氨鐘2g/L，抑7.2。搖 床轉速為280r/min，29°C培養7化后，種入發酵培養基，搖床轉速為280r/min，29°C培養 4化后，補入維生素化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止 發酵，測定發酵效價，與出發菌株相比，自養假諾卡氏菌突變株相對效價分布情況見表1，挑 選出發酵效價較高的菌株20支進行復篩。
[0029] 表1自養假諾卡氏菌突變株相對效價分布
從表1可知，采用該模型進行篩選，獲得自養假諾卡氏菌正突變的比例較高，達到30% 復篩：將挑選出的效價較高的20支菌株接種到種子培養基，搖床轉速為280r/min， 29°C培養7化后種入發酵培養基中，搖床轉速為280r/min，29°C培養4化后，補入維生素 化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止發酵，測定發酵效 價，挑選出效價最高的菌株1支，保存，備用。
[0030] 發酵培養基試驗：將效價最高的菌株進行發酵培養基試驗。按如下配方配制種子 培養基100mL:蛋白腺15g/L玉米漿15g/L葡萄糖15g/L黃豆粉4g/L氯化鋼5g/ L憐酸二氨鐘2g/L，pH7. 2。將種子培養基裝入3個250mlS角瓶中，每瓶30ml。滅菌后， 從斜面菌株挖塊接入種子培養基中，搖床轉速為280r/min，29°C培養72h，將種子液分別接 入含有不同濃度聚山梨醋-80的發酵培養基中進行發酵試驗，接種量為10% (V/V)。
[0031] 按照如下配方配制發酵培養基：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15旨/1，黃 豆粉4g/l，氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，倍他環糊精3邑/1，聚山梨醋-80 1.0、2.0、 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. O g/L，抑7. 2。搖床轉速為280 r/min，29°C培養4她后，補 入維生素化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養3天，停止發酵，測 定發酵效價，所對應的測定結果見表2。
[0032]HPLC方法：色譜柱為Kromasil正相硅膠柱（250X4. 6mmi.d，5um)，流動相為異丙 醇-正己燒（1 : 9)，流速1.5ml/min，柱溫為40°C，檢測波長265皿。
[0033] 對含有不同聚山梨醋-80濃度的培養基進行綜合比較，篩選出最佳發酵配方。
[0034] 表2實驗測定結果
從表2中可W看出，配方中聚山梨醋-80的濃度在3-8g/L時，25徑基維生素化的效價 較高，7g/L時25徑基維生素化效價最高。
[0035] 實施例2: 誘變：將自養假諾卡氏菌（Pseudonocardiaautotrophica)單抱子懸液通過EMS誘 變：將出發菌株成熟斜面用抑7. 0的憐酸鋼緩沖液制成單抱子懸液，經振蕩，玻璃珠分散 30min，無菌過濾收集單抱子懸液約IOml(使其抱子的終濃度達到120-130個/ml),加入 燒化劑EMS，終濃度為3%，振蕩處理30min，加入硫代硫酸鋼終止反應，振蕩20min。
[0036] 初篩：按照如下配方配制分離培養基化：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l，玉米漿3 g/L，氯化鋼4g/L，瓊脂15g/L，聚山梨醋-80 15g/L，抑7.0。準備無菌培養皿100個，培 養基滅菌后倒入培養皿中做成平板。
[0037] 將誘變處理后的單抱子懸浮液Iml稀釋后涂布于平板上，29°C培養箱中培養 168h〇
[0038] 按照如下配方配制斜面培養基化：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l，玉米漿3g/l， 氯化鋼4g/L，瓊脂15g/L，PH7.0。準備試管120支，制成斜面備用。
[0039] 在含有高濃度聚山梨醋-80平板中挑選生長和產抱良好的菌株接種于斜面上，在 29 °C培養箱中培養16化。斜面成熟后挖塊種入種子培養基中，同時將用于誘變處理的出 發菌株斜面也挖塊種入種子培養基中，作為對照，種子培養基成分和含量