篩選25羥基維生素d3高產菌株和發酵培養基中聚山梨酯-80含量的方法
【專利說明】篩選巧超基維生轟〇3高產菌株和發醒培養基中聚山梨 醋-80含量的方法
[0001]
技術領域： 本發明設及一種篩選25徑基維生素化高產菌株和發酵培養基的方法。
[000引【背景技術】： 骨質疏松癥（Osteoporosis,OP)日益成為嚴重威脅老年人的健康的一種慢性疾病；維 生素D類藥物中的25徑基維生素化是自然存在人體內的維生素D3的活性代謝產物；多年 來，25徑基維生素化主要用于治療老年人骨質疏松癥等各種慢性骨素亂，W及與慢性腎衰 竭有關的代謝性骨疾病，低巧血病，另外，近年也作為飼料添加劑用于飼料行業。
[0003] 25徑基維生素化的制備有化學合成和生物發酵兩種方法；化學合成反應步驟繁 多、需要昂貴試劑、反應過程中會產生外消旋體，需要進行復雜的拆分過程，不僅大大影響 收率，而且難W拆分完全，而且化學合成生產25徑基維生素化會對環境產生較大的污染。 而微生物發酵的方式能夠利用微生物細胞內的酶特異性的解決25徑基維生素的手性 結構問題，其生產條件溫和，收率高，成本低廉，環境友好，成為一種有效替代化學合成的方 法。
[0004]隨著25徑基維生素化市場需求量正日益擴大，優良的25徑基維生素D3高產菌株 就成為發酵生產25徑基維生素化的關鍵。
[0005] 從當前國內生物技術產業來看，目前高產的工業生產菌種的獲得主要還是采用 隨機選育，包括自然選育、誘變育種和W原生質體融合為代表的雜交育種技術，常常正突變 率低，導致篩選工作量大，費時費力，從而不易篩選到高產菌株。
[0006] 由于細胞膜對底物和產物的透性屏障作用，常導致微生物細胞的轉化效率低下。 主要表現為細胞催化效率一般比酶催化效率低10到100倍。此外，如果產物不能及時從 細胞中釋放出來而在其中過度積累，通常會造成反饋抑制效應，使目標產物的得率下降。因 此，有必要采取措施來改善細胞膜對底物及產物的傳質阻力，利用細胞膜通透性的變化來 提高微生物的代謝通量，提高菌體發酵過程中的催化效率，從而提高目標產物的產量。利用 細胞膜通透性的變化來提高微生物的代謝產物產量已經逐步應用到發酵產業中。例如，汪 江波(汪江波.調控細胞通透性W提高透明質酸的產量和分子量.華西藥學雜志，2006,21 (5):465 ~ 467)報道了誘變選育甘油缺陷型菌株，添加甘油調控使得細胞膜的通透性大大 增加，大幅提高了透明質酸的產量。魏娜(魏娜.丫-亞麻酸產生菌深黃被抱霉細胞膜通透 性調控的研究(碩±學位論文）.上海水產大學，2007)報道了W深黃被抱霉甜RJ-13為出 發菌株，通過低頻超聲波4min與制霉菌素0. 05ml方法使得菌體細胞膜通透性的增加，從而 提高了丫-亞麻酸產率。胡炎華(胡炎華.逐級誘變及細胞膜通透性調節改造谷氨酸棒桿 菌.2011年國際氨基酸產業創新與聯盟發展高峰論壇論文集，152~156)報道了通過香豆 素抗性篩選，增加細胞膜通透性提高了谷氨酸產量。
[0007]
【發明內容】
： 本發明的目的是提供了一種培養基原料來源廣，成本低，出發菌株正突變株的幾率高、 突變株25徑基維生素化效價高的篩選25徑基維生素D3高產菌株的方法。
[0008] 本發明的另一個目的是提供了一種25?基維生素化高產菌株生產25?基維生 素化的發酵培養基中聚山梨醋-80含量的篩選方法。
[0009] 本發明是運樣實現的： 篩選25徑基維生素化高產菌株的方法，包括如下步驟： (1) 初篩：將誘變處理的自養假諾卡氏菌單抱子懸浮液稀釋后涂布于含有聚山梨 醋-80含量為15-20g/L的分離培養基做成的若干平板上，在29°C培養箱中培養144-19化， 從若干平板中挑選生長和產抱良好的菌株接種于斜面培養基制成的若干斜面上，在29°C 培養箱中培養16化，斜面成熟后挖塊種入=角瓶中的種子培養基中，同時將用于誘變處理 的出發菌株斜面也挖塊種入S角瓶中的種子培養基中，作為對照，搖床轉速為280r/min， 29 °C培養7化后，種入發酵培養基，將S角瓶置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29 °C培養 4化后，補入維生素化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止 發酵，測定兩種菌的發酵效價，與出發菌株相比，選出自養假諾卡氏菌突變株相對發酵效價 較高的菌株若干支進行復篩， (2) 復篩：將發酵效價較高的若干菌株接種于若干=角瓶中的種子培養基中，將=角瓶 置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養7化后接種于若干個S角瓶中的發酵培養 基中，將S角瓶置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養4化后，補入維生素化，使得 維生素化在發酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續培養72h，停止發酵，測定若干個S角瓶中 的發酵培養基發酵效價，挑選出一個=角瓶中發酵效價最高的一支菌株為最終產品。
[0010]25徑基維生素高產菌株生產25徑基維生素D3的發酵培養基中聚山梨醋-80 含量的篩選方法，將種子培養基裝入3個250ml=角瓶中，每瓶30ml，滅菌后，從25徑基 維生素化高產菌株的斜面挖塊接入3個=角瓶種子培養基中，將=角瓶置于搖床上，搖床 轉速為280r/min，29°C培養72h，將3個S角瓶中的種子液分別移入含有不同含量聚山 梨醋-80的若干個=角瓶中的發酵培養基中進行發酵試驗，將=角瓶置于搖床上，搖床轉 速為280r/min，29 °C培養4化后，補入維生素化，使得維生素化在發酵液中的終濃度為 500ug/ml，繼續培養3天，停止發酵，測定發酵效價，確定一個S角瓶中的發酵效價最高的 發酵培養基，其聚山梨醋-80的含量為最佳值。
[0011] 所述的步驟（1)中所述分離培養基成分和含量為：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/l， 玉米漿3g/l，氯化鋼4g/l，瓊脂15旨/1，聚山梨醋-80 15g/l，PH7.0。
[0012] 所述的步驟（1)中所述斜面培養基成分和含量為：葡萄糖15g/l，蛋白腺10g/ 以玉米漿3g/l，氯化鋼4g/l，瓊脂15g/l，PH7.0。
[0013] 所述的種子培養基成分和含量為：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15g/l， 黃豆粉4肖/1，氯化鋼5肖/1，憐酸二氨鐘2肖/1，抑7.2。
[0014] 所述的含聚山梨醋-80量不同的發酵培養基，聚山梨醋-80含量分別為1-9g/L 中之一，其他成分和含量均為：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15g/l，黃豆粉4g/ 以氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，倍他環糊精3g/l，pH7. 2。
[0015] 步驟（I)中所述誘變處理為將出發菌株自養假諾卡氏菌成熟斜面用生理鹽水制 成單抱子懸液，經振蕩，玻璃珠分散30min，無菌過濾收集單抱子懸液約IOml于無菌培養皿 中，使其抱子的終濃度達到120-130個/ml,紫外功率30W，燈距25cm照射30s。
[0016] 步驟（1)中所述誘變處理為將出發菌株自養假諾卡氏菌成熟斜面用抑7. 0的憐 酸鋼緩沖液成單抱子懸液，經振蕩，玻璃珠分散30min，無菌過濾收集單抱子懸液約10ml， 使其抱子的終濃度達到120-130個/ml,加入燒化劑甲基橫酸乙醋EMS，終濃度為3%，振蕩 處理30min，加入硫代硫酸鋼終止反應，振蕩20min。
[0017] 發酵培養基中聚山梨醋-80的含量為3 -8g/L。
[0018]針對隨機選育正突變率低，工作量大，不易篩選到高產菌株的缺點，本發明提供了 一種篩選25徑基維生素化高產菌株的方法，該方法在常規誘變選育的基礎上，結合調控細 胞膜通透性的方法，能有效地提高獲得正突變株的幾率，為25徑基維生素化發酵生產提供 優良菌種，從而提高25徑基維生素化發酵生產水平。
[0019] 表面活性劑主要是通過影響細胞膜上脂質分子間和脂質分子與膜蛋白之間的相 互作用