克服富含糖類的植物材料在氨化 中的酸化作用的方法。植物材料可在米曲霉預處理之前滅菌，或不滅菌。
[0139] 表11。進行或不進行每天抑調節（使用未滅菌的培養基），或用米曲霉預處理14 天（培養基在米曲霉接種前不滅菌或滅菌），在不同的植物材料上S1種群的氨產生。氨產 生表示為在7天內N轉化為氮的百分數。結果為兩次生物重復實驗W及每個樣品的Ξ次重 復測量的平均值。在用米曲霉的實驗中，進行兩次生物重復米曲霉培養W及兩次生物重復 S1培養。
[0140]
[0141] 實施例7
[0142] 作為氨化群落的固有種群W及接種的源自肉骨粉的種群
[0143] 用苯酪-氯仿異戊醇從培養物提取獲得DNA，其中細胞已被珠磨破壞，在該DNA上 進行肉雞副產品（CBP-M)、豬/牛副產品（PB-M)、雞毛（FE-M)、魚副產品（MF-M)W及碎豬/ 牛骨（CB-M)的固有種群的細菌群落分析。20% (重量/體積）材料在50°C下解化四天（FE 為8天），從中培育并獲得培養的種群。如Dowd等2008a和Wolcott等2009所述，研究測 試實驗室（美國德克薩斯州盧博克市）通過標簽編碼FLX擴增子焦憐酸測序化TEFA巧進 行細菌16S基因檢測和細菌多樣性數據分析。引物28F'GAGTTTGATCNTGGCTCAG'（SEQID N0:1)和 519R<GTNTTACNGCGGCKGCTG'（沈QIDN0:2)用于擴增 16S可變區V1-3。
[0144] 結果。固有和接種群落的細菌多樣性分析顯示細菌屬于58個不同的屬（表12)。 在總共115個結果中，79個在種水平上一致，36個在屬水平上一致。表13展示每個種群 中主要的細菌屬和種。屬于5-9個不同的屬的細菌形成種群的大部分。在由S1接種的材 料獲得的種群中，若干種梭菌（Clostridiumspp.)和Sporanaerobacteracetigenes是 主要的，和PB-M和MF-M的固有種群一樣。另外Ξ種固有種群顯示更多的變化：CBP-M主 要包括若干種腸球菌巧nterococcusspp.)和若干片球菌（Pediococ州Sspp.)，陽-M種 群為產班巧酸油桿菌（Petrobactersuccinatimandens)、非解糖nhP林單胞菌（Soehngenia saccha;rol5ftica)、一種泰氏菌（Tissierellasp.)和若干種梭菌（Clostridiumspp.)，CB-M種群為一種纖發菌(Xeptot虹ixsp.)、和若干種施萊格爾氏菌（Schlegelellaspp.)。
[0145]用方程式[1]由表12中所示數據計算得到相關系數（表14)，其中X和Y指兩種 基質，例如CBP-M和CBP，計算兩者之間的相關性，X和y是基質中的單一值，聚和F是基質中 所有值的平均值。種群中未出現的種（表12中空白單元格）賦值為0。
[0146]
0]
[0147] 表14掲示了所有五種接種材料中的種群和固有種群PB-M和MF-M之間的高相似 性。其余的固有種群CBP-M、FE-M和CB-M互相的相似性低，與同其他種群一樣。如上所述 根據表3的結果，S1超過源自動物材料中的固有種群。但是，能夠在所用條件下，在源自動 物的材料（PB-M和MF-M)中產生與S1相似的種群。運很有可能是因為S1和其它有效氨 化種群A1、C1、H1和P1 (參見實施例5)的來源骨肉粉，是由各種動物種類的屠宰副產品制 得。但是，CBP、FE和CB的固有種群和接種種群的比較顯示細菌群落可在相似條件下發展 成不同組成。表14還指出氨產率，即在獲得用于DNA提取的種群時，源自動物材料中的氮 轉化為氨的百分數。該產率與固有種群與接種種群之間的相似性有關。只有當相關系數大 于0. 9,或優選大于0. 95時，產率達到40 %或更高。
[0148] 表12.細菌多樣性分析結果：源自動物材料的種群的屬和種：肉雞副產品 (CBP-M)、豬/牛副產品（PB-M)、雞毛（FE-M)、魚副產品（MF-M)和碎豬/牛骨（CB-M)。多 樣性分析也可在用5% (體積/體積）肉骨粉產生的種群S1進行接種的相同材料上進行。 如同表1中展示的一樣，運些結果標記為CBP、PB、陽、MF或CB。結果示為總種群的百分數。
[0149]
[0153]表13.種群〔8口-]?、〔8口、口8-]\1、口8、陽-]\1、陽、]\^-]\1、]\^、〔8-]\1和〔8中的主要的細菌 屬和種。結果示為總種群的百分數。
[0154]
[0155]
[0156] 表14.用方程式[1]由表12中所示數據計算得到的混合種群的細菌多樣性之間 的相關系數。產率（末行）為獲得用于DNA提取的種群時，源自動物材料中的氮轉化為氨 的百分數。
[0157]
[015 引
[0159] 實施例8
[0160] 由來源于±壤和肉骨粉的種群進行氨化的效率
[0161] 為了對比來源于肉骨粉和其它來源的種群的細菌群落組成和氨化表現，由森林和 田間±壤培養天然種群。
[0162] 通過W每升水含180g±壤的比例，混合未滅菌的森林±壤（F0)或田間±壤（FI) 與冷自來水，生成F01和FI1種群。該混合物在50°C下不通風培養。通過W每升水含180g ±壤的比例，混合未滅菌森林±壤（F0)或田間±壤（FI)與沸騰的自來水，生成F02和FI2 種群。混合物冷卻至室溫。所有的混合物在50°C下不通風解化。在解化7天后，5ml的每 個培養物在每升水中含ISOgMBMl的100ml無菌MBM1培養基中接種。培養物在50°C下不通 風培養7天。
[0163] 用苯酪-氯仿-異戊醇從培養物提取獲得DNA，其中細胞已被珠磨破壞，在該DNA 上進行±壤種群的細菌群落分析。如Dowd等2008a和Wolcott等2009所述，研究測試實 驗室（美國德克薩斯州盧博克市）通過標簽編碼FLX擴增子焦憐酸測序化TEFA巧進行細 菌16S基因檢測和細菌多樣性數據分析。引物28F'GAGTTTGATCNTGGCTCAG'(沈QIDN0:1) 和 519R<GTNTTACNGCGGCKGCTG'（沈QIDN0:2)用于擴增 16S可變區Vl-3。
[0164] 結果。源自±壤和MBM的種群的細菌多樣性分析掲示了細菌屬于45個不同的屬 (表15)。在總共的85個結果中，66個在種水平上一致，19個在基因水平上一致。表16展 示了每個種群中的主要細菌屬和種。屬于6-7個不同屬的細菌形成種群的大部分。若干 種梭菌和Sporanaerobacteracetigenes在源自MBM的種群中是主要的，如F01和FI1 - 樣。其他兩種上壤種群顯示更多的差別：F02主要包括若干種芽抱桿菌度acillusSPP.)、 若干種熱厭氧桿菌（Thermoanaerobacteriumspp.)、和若干種梭菌（Clostridiumspp.)， FI2為若干種梭菌（Clostridiumspp.)、一種泰氏菌（Tissierellasp.)和一種喜熱菌 (Caloramatorsp.)。
[0165] 用方程式[1]由表15中所示數據計算得到相關系數（表17)，其中X和Y指兩種 基質，例如A1和C1，計算兩者之間的相關性，X和y是基質中的單一值，繁和聚是基質中所有 值的平均值。種群中未出現的種（表15中空白單元格）賦值為0。
[0166]
的
[0167] 表17顯示所有五種源自MBM的種群之間，^及±壤種群F01和FI1之間，具有高度 的相似性（相關系數〉〇. 9)。因此，可從±壤產生類似于源自MBM種群的種群。F02和FI2 的相關系數低于0. 2,表示相似性低。因此，將±壤溶于沸水中對于對氨化很重要的細菌是 致命的。表17還表明錠產率，即在獲得用于DNA提取的種群時，MBM中的氮轉化為氨的百 分數。該產率和固有種群與接種種群之間的相似性有關。只有當相關系數大于0.9時，產 率達到40 %或更高。
[016引表15.細菌群落多樣性分析結果：在源自±壤和肉骨粉種群A1、C1、H1、P1和S1 中的屬和種。源自肉骨粉種群A1、C1、H1、P1和S1的結果與表1中所展示的一樣。結果示 為總種群的百分數。
[0169]
[0170] L〇17U
[0172] 表16.源自181和±壤的種群中的主要細菌屬和種。結果示為總種群的百分數。
[0173]
[0174]
[0Π5] 表17.用方程式[1]由表15中所示數據計算得到的混合種群之間的細菌多樣性 的相關系數。產率（末行）為獲得用于DNA提取的種群時，源自動物材料中的氮轉化為氨 的百分數。
[0176]
[0177] 實施例9
[017引源自牛瘤胃和肉骨粉的種群的氨化效率
[0179] 為了對比源自肉骨粉與其他來源的種群的氨化表現，研究牛瘤胃種群。過量的 氨產生是反當動物中營養效率低下的主要原因。大多數瘤胃的氨基酸分解代謝活性W及 由此的氨產生活性是由于某些被稱為高產氨菌（HAB)的細菌，（Russell等1988;化en和 Russell1989;Krause和Russell1996，Eschenlaue;r等.2002)。因此，瘤胃可為高效氨化 細菌的來源。
[0180] 試圖通過在無菌MBMl中培養牛瘤胃細菌的過量循環增強氨化種群。牛瘤胃含量 從開桐牛（fis化latedcow)獲得，并且過濾將液體與固體分離。將液體加至MBM1培養基 [每升水中含180g肉骨粉]，作為25% (體積/體積）接種物，在37°C下不通風培養。每 個增強循環持續7天，W使氨化反應充分進行。
[0181] 結果。在第一個Ξ次增強循環期間，氨產率即氮轉化為氨的百分數從12.3% ±6. 6%增至24. 7% ±3. 1%，但是在接下來的四個循環期間保持同樣的水平。如實施例 1的圖1所示，源自MBM的種群在37°C產生較高的氨產率，從37. 9% ±2. 3%到58. 8 % ± 13. 9%。因此，盡管得到增強，瘤胃種群的氨化不如源自MBM種群有效。
[0182] 增強的瘤胃種群不進行群落多樣性分析。Fonts等（2012)在他們對十二只 母牛的瘤胃種群的研究中報道了，百分之八十的細菌在種水平上一致，它們屬于梭菌目 (Clostridiales)、擬桿菌目度acteroidales)、丹毒絲菌目巧rysipelotrichales)W及 未歸類的TM7。該組成有別于源自MBM種群A1、C1、H1、P1和S1 (表2)的組成，其中所 包括的細菌94 - 98%屬于梭菌目（〔1〇3付1山3163)(喜熱菌屬（〔31〇阿11131：01')、梭菌屬 (Clostridium)、Sporanaerobacter屬、Garciella屬和泰氏菌屬（Tissierella).
[0183] 討論
[0184] 根據實驗，很清楚比起現有技術，使用限定的混合種群的氨化得到更優的產率。使 用上述的種群，根據使用的起始材料/培養基的蛋白質含量，獲得高達12g/l的氨濃度。與 現有技術相比較，氨化率有15-30倍的提高。典型地，發現在24-48小時內，培養基中總氮 的50 %至80 %轉化為氨。
[0185] 在圖6中示出了屠宰場副產品/廢物的氨化過程的示例環境100。有機材料（副 產品）儲存于容器106中。在容器106中的廢物供至生物反應器104。水從水源102加至 生物反應器104。接種體由來源116加至生物反應器104。接種體的種類選自H1、C1、P1、 S1和A1。優選地，接種體來源于S1的混合種群。生物反應器具有混合/攬拌裝置105W 及加熱/溫度控制裝置110。根據實施方式，加熱件110用于將生物反應器104的內容物加 熱至約50攝氏度（種群S1為40-55攝氏度）。如果需要，可通過向生物反應器104加入堿 (比如化0H)控制抑，W保持抑高于6。發酵時間優選為約16-48小時。
[0186] 在發酵過程期間，使用混合細菌種群，將錠/氨釋放至發酵液體。可不時取出生物 反應器104中的液體樣品，W追蹤過程的進度。追蹤的參數為液體中的氨/錠濃度。例如， 在本發明的某些實施方式中，當兩個連續取樣之間的氨/錠濃度變化沒有顯示出顯著增加 時，發酵過程是完整的或充分的。
[0187] 來自生物反應器104的所有或部分液體可被引至反萃相108,從液體中提取作為 氨（NH3)的錠/氨。氨可被儲存在容器112中，W備將來使用，比如部分肥料生產。或者， 部分或所有液體可被引至容器113中，直接用作肥料。
[018引將所有或一些液體移除后，剩余的固體和/或液體可收集在倉庫114中W備將來 使用。114中的部分材料也可回供至生物反應器104,用作下一批的接種物。此外，一些液 體和/或固體可留在生物反應器104中構成下一批的基礎。
[0189] 在發酵過程中，通過培養基的酸化，可抑制具有高糖類含量的植物材料的氨化。可 向培養基中加入堿（比如