通過由混合細菌種群進行的氨化從有機材料提取氮的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明大體設及一種通過使用微生物的混合種群進行微生物發酵或培養的過程， 從有機原材料中制備氨和/或錠的新方法。
【背景技術】
[0002] 氨（N&)是世界上最廣泛制備的化合物之一。2010年全球產量達到131兆公噸 (2012年美國地質調查局）。大部分制備的氨用于化學肥料，W向農作物提供生長所需的 氮。氨還用于制造塑料、合成橡膠和樹脂、炸藥、W及許多其他化合物。
[0003] 氮循環是氮在其不同的化學形式之間轉化過程。氮在有機大分子中的礦化，即有 機氮轉化為錠或氨，被稱為氨化。有機氮W氨的形式釋放是氮循環的一部分，其通過氨化細 菌完成。
[0004] 氨化可用于從有機廢料中釋放氮。例如，W全文并入本文作為參考的序列號為 13/722, 228的美國專利申請公開了一種氨化方法。在該'228申請的方法中，培養基中的有 機材料與水解酶接觸，W制備含有水解或部分水解的有機材料、適用于微生物發酵或培養 的培養基。該氨化在存在至少一種能夠氨化的微生物的情況下進行。該微生物可屬于例如 氣單胞菌屬（Aeromonas)、巧樣酸桿菌屬（Citrobacter)、梭菌屬（Clostridium)和腸球菌 屬巧ntrococcus)。該方法中錠的產率達到約800mg/升。
[0005][0006]因此，本領域仍長期需要另外的經濟的方法來從有機材料（例如有機廢料）中制 備氨。
【發明內容】
[0007] 相應地，本申請提供一種用于從有機材料中制備氨或錠的方法，該方法包括如下 步驟：
[0008] 在好氧或厭氧條件下，在能夠氨化的混合細菌種群的存在下，發酵包括有機材料 的液體培養基，其中該發酵在一定條件下進行充足的時間，產生包括氨或錠的發酵產物；
[0009] 其中有機材料包括適用于轉化為氨或錠的含氮化合物。優選地，該含氮化合物為 胺類或蛋白質。
[0010] 在本發明的某些實施方式中，該方法在溫度為30至60攝氏度的范圍內進行。更 優選地，該方法在溫度為40至55攝氏度，或40至50攝氏度的范圍內進行。
[0011] 在本發明的某些實施方式中，該方法在抑值為約5至約11的范圍內進行。更優 選地，該方法在抑值為約6至約9的范圍內進行。
[0012] 在本發明的某些實施方式中，該發酵過程可在厭氧或好氧條件下，在適合的反應 室或反應容器中進行一段時間，并且在對有機材料的高效減少有效的溫度范圍中進行。
[0013] 優選地，該過程采用混合細菌種群進行，該混合細菌種群包括與選自HI、Cl、PI、 S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FIl的混合細菌種群基本相似的混合細菌種群。相對于選自HI、 Cl、P1、S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FI1中的混合細菌種群，該基本相似的混合細菌種群優選 相關系數為0. 80,更優選地相關系數為0. 90,甚至更優選地相關系數為0. 95。
[0014] 在某些實施方式中，該混合細菌種群與S1的混合細菌種群（CBS保藏號136063) 基本相似。相對于S1的混合細菌種群，與S1基本相似的混合細菌種群優選相關系數為 0. 80,更優選地相關系數為0. 90,甚至更優選地相關系數為0. 95。
[0015] 在另外的實施方式中，混合細菌種群中至少一半的細胞包括Sporanaerobacter acetigenes和 / 或若干種梭菌（Clostridiumspp.)。
[0016] 在另一實施方式中，混合細菌種群包括50-95%的Sporanaerobacteracetigenes 和3-35%的若干梭菌。該Sporanaerobacteracetigenes和/或若干種梭菌的累計含量 為70 %或更多。優選地，該混合細菌種群包括50-90 %的Sporanaerobacteracetigene和 5-15%的若干種梭菌。
[0017] 在另一實施方式中，該Sporanaerobacteracetigenes和/或若干種梭菌的累計 含量為85%或更多。在另外的實施方式中，該混合細菌種群包括至少90%屬于梭菌目的細 困。
[0018] 優選地，該發明的方法還包括從發酵產物中機械地或通過沉淀回收氨或錠。該氨 或錠可選擇地通過下列步驟回收：
[0019] (a)分離固體和液體發酵產物；
[0020] 化）收集包括氨或錠水的液體發酵產物，或收集在發酵過程或分離步驟（a)期間 釋放的氣體混合物；W及
[0021] (C)回收氨或錠。
[0022]在根據本發明的方法中，有機材料優選為下列中的一種或多種：肉骨粉（MBM)、動 物粉、動物副產品、屠宰場廢物、乳清、城市廢物、食品和發酵工業廢水及其組合。該食品工 業廢水為例如動物副產品、動物粉或食物廢物。
[0023] 在又一實施方式中，本發明包括混合細菌種群，該混合細菌種群與選自H1、C1、P1、 S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FI1的混合細菌種群基本相似。優選地，該混合細菌種群與S1的 混合細菌種群基本相似。
【附圖說明】
[0024] 圖1表明了實施例1中通過混合細菌種群A1、C1、化、P1、S1，測定肉骨粉（"MBM") 蛋白氮氨化的最佳溫度范圍。運些結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即各個溫度下解化7 天后的氨化效率。誤差條表示兩次生物重復之間的標準差（standarddeviation)。由A1、 Cl、化和P1氨化的最佳溫度范圍為37至55°C，S1的溫度范圍為37至60°C。"RT"表示室 溫。
[0025] 圖2表明了實施例1中通過混合細菌種群A1、C1、H1、P1和S1，測定MBM蛋白氮氨 化的最佳抑范圍。運些結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即50°C解化7天后的氨化效率。 誤差條表示兩次生物重復之間的標準差。由A1、C1、H1、P1和S1氨化的最佳抑范圍為6至 9。"N"表示化合物中轉化為畑3的氮。
[0026] 圖3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G和3H表明了實施例2中通過混合細菌種群H1、C1、P1、 SI和Al，不同有機材料的氨化效率。誤差條表示兩次生物重復之間的標準差，其中每次生 物重復進行Ξ次技術重復。有機材料：圖3A為魚產品，圖3B為肉雞產品，圖3C為牛/豬產 品，圖3D為生物乙醇糊，圖3E為肉骨粉1，圖3F為肉骨粉2,圖3G為魚粉，圖3H為羽毛粉。 該結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即在50°C解化不同時間段后的氨化效率。S1種群很突 出，它有效地氨化圖3D和3G所示的材料，然而H1快速地氨化圖3C、3D和3E所示的材料。 總之，與未接種的對照物相比，所有五種種群的氨化效率都有所提高。運個效果在圖3C、3D、 3E和3F中示出的材料中尤其明顯，"d"表示天數。
[0027] 圖4表明實施例4中魚副產品培養基和雞副產品培養基在生物反應器內，在巧(TC 不含細菌接種體W及使用P1細菌種群的氨化。該誤差條顯示Ξ次重復的氨測量值的標準 差。
[002引圖5說明在實施例5中用于誘發來自兩個不同廠商（MBM1和MBM2)的未滅菌的肉 骨粉（"MBM")中混合種群的溫度范圍的測定。該結果顯示為氮轉化為氨的百分數，即在 不同溫度下解化7天后的氨化效率。誤差條表示兩次生物重復之間的標準差，除了MBM1在 45°C重復4次，在55°C重復7次。MBM2種群在室溫（RT)和70°C之間能有效誘發，但是MBM1 在50°C獲得最佳的有效氮轉化。"RT"表示室溫。
[0029] 圖6表明在下文討論部分中屠宰場副產品的氨化過程的實施例。
【具體實施方式】
[0030] 本發明提供了一種通過混合細菌種群進行氨化從有機材料提取氮的方法。有機材 料可為任意富含蛋白質的有機材料，例如源自動物或植物。為了更清楚地了解本發明，對下 列術語進行定義。除非另外指出，下列的術語如表明的進行使用和限定。貫穿說明書全文 可對其他術語進行定義。除非另外指出，所有單稱詞還涵蓋該詞的復數、主動語態和過去式 的形式。
[0031] 術語"含氮化合物"指通過本發明的方法，適用于轉化為氨或錠的氮化合物，例 如有機氮，包括胺類、蛋白質等等。運種有機材料的例子包括含胺的材料，例如蛋白質材 料，例如肉骨粉（MBM)、屠宰場廢物、乳清、城市廢物、魚粉、食品工業廢水，例如動物和植 物副產品，包括但不限于肉骨粉、魚、羽毛W及甜菜根、豆類、水果、制糖業廢物。本文所用 的術語"MBM""肉骨粉"由第142/2011號歐盟委員會條例巧uropeanUnionCommission Regulation)限定："肉骨粉指根據附錄IV第III章中陳述的其中一種加工方法，從種類1 或種類2材料的加工中獲得的動物蛋白"。
[0032] 本文所用的術語"動物粉"為由動物材料（比如屠宰場廢物）制得的粉。在下文 的實施例中，"動物粉"為粉狀材料。制造該粉的一種過程是將屠宰場廢物的水分抽出（即 進行干燥），然后娠磨干燥的固體。
[003引"源自植物的材料"如下文所限定。"生物乙醇糊（bioethanolmask) " (Stl公司， 芬蘭）指源自生物乙醇生產的發酵廢物。"大麥塊化arleybriquette) "(Senson公司，芬 蘭）為麥芽汁生產的副產品，并且"大麥糊化arleymask)"(Senson公司，芬蘭）為大麥酶 生產的副產品。"小麥塊（Wheatbriquette)"(化op化ergies公司，德國）和"油菜餅（Rape cake) " (Mildola公司，芬蘭）為生產來喂給動物的材料。
[0034] 本文所用的術語"動物飼料"指制備為喂給動物的食物。
[0035] 術語"發酵"或"發酵過程"指有機分子作為電子供體和電子受體的過程。該過程 與呼吸不同，呼吸中，來自營養分子的電子供給至氧氣（有氧呼吸）或其他無機分子/離 子，比如硝酸鹽、硫酸鹽、二氧化碳或Ξ價鐵離子（無氧呼吸）。在發酵中，營養分子降解為 小的有機分子，比如揮發性脂肪酸和醇類。此外，術語"發酵"用于描述在封閉容器中的生 長培養基上的微生物生長，該容器例如生物反應器或發酵器。
[0036] 術語"氨"指為氣態形式或W非電離形式溶解于培養基中的化合物畑3,該培養基 例如液體培養基。術語"錠"指離子NH/，其為NH3在例如水溶液中的離子形式。在水溶液 中，錠和氨處于平衡，該平衡取決于溫度和抑值，例如溫度越高，抑值越大，W氨的形式的 比例越大。所W，除非另外指出，關于本發明方法和/或氨化微生物及其產品，本文中所指 的"氨"應該被理解為包括關于該化合物的畑3和NH/兩種形式。例如，將氨化微生物作為 "氨產生"或"錠產生"進行討論，理解為包括根據特定培養基中的NH3/NH4+平衡，制備NH3和 /或NH/。作為"氨產生"或"錠產生"的氨化微生物的討論理解為根據特定培養基中的畑3/ 畑/平衡，包括NH3和/或NH/的產生。
[0037] 術語"氨化"指有機大分子中的氮的礦化，即有機氮轉化為錠或氨。該氨化由細 菌氨化實現，其包含蛋白質酶法水解為氨基酸，W及通過去氨基和消除反應，氮釋放為氨/ 錠。氨基酸的碳鏈發酵為有機酸，同時釋放二氧化碳和氨。
[0038] 術語"統一形式"，可于本文中在從發酵產物或培養產物中回收錠和氨的上下文中 所使用，指錠離子轉化為另外的化學形式，比如非離子氨（N&)和/或任意已知含氮化合 物，例如由氨與硝酸、硫酸、鹽酸、憐酸或其它化合物分別反應形成的化合物。
[0039] 氨化混合細菌種群包括種群H1、C1、P1、S1、A1、PB-M、MF-M、F01和FI1及其各種 變形，其將在下文中詳細描述。
[0040] 用苯酪-氯仿-異戊醇從細菌培養物提取獲得DNA，其中細胞已被珠磨破壞，在該 DNA上進行混合種群H1、C1、P1、S1和A1的細菌群落分析。種群在無菌MBM培養基[每升 水含180g肉骨粉（MBM)]或動物源材料中，在37°C、50°C或55°C下培養四天。如Dowd等 2008a和Wolcott等2009所述，研究測試實驗室（美國德克薩斯州盧博克市）通過標簽編 碼FLX擴增子焦憐酸測序化TEFA巧進行細菌16S基因檢測，W及細菌多樣性數據分析。引 物 28F<GAGTTTGATCNTGGCTCAG'（沈QIDN0:1)和 519R<GTNTTACNGCGGCKGCTG，（SEQID NO:2)用于擴增16S可變區Vl-3 (其中"N"為A、T/U、G或C，并且其中Κ為T/U或G)。
[0041] 細菌多樣性分析披露了細菌屬于35個不同的屬（表1)。在總共的53個結果中，33 個在種水平上一致，而20個在屬水平上一致。表2示出每個種群中主要的細菌屬和種。屬 于第6-8屬的細菌形成所有種群的大部分。若干種梭菌和Sporanaerobacteracetigenes 在所有種群中為主要的。在55°C下培養的SI中，若干種喜熱菌（Caloramatorspp.)與若 干種梭菌一樣常見。
[0042] 用方程式山由表1中所示數據計算