表錯誤折疊的DAS181的峰1的面積在運行A和B中比在參考標準中更少。運 行A和B藥物物質的峰4和峰F的面積百分比與參考標準一致。
[0088] 運行A和B中產生的最終藥物物質的進一步純化的分析分別測量為15ng/mg和 33ng/mg(表6)。這些值低于或接近該測定的定量限度（16ng/mg)。最終藥物物質的進一步 純化的產物水平被確定為與在替代性純化的產物中所發現的水平幾乎相同。
[0089] 表6 :進一步純化的產物的ELISA分析比較
[0090]
唾液酸酶比活性的分析顯示了在運行A和B中產生的最終藥物物質分別為827U/ mg和847U/mg(表7)。唾液酸酶比活性與與樣品一起運行用于質量控制的DAS181參照標 準（826U/mg)相當。
[0092] 表7:唾液酸酶活性分析比較
[0093]
[0094] 小規模整合的運行A和B中產生的最終藥物物質的內毒素分析分別測量為 0. 018EU/mg和0. 043EU/mg(表8)。DAS181藥物物質的內毒素規格為0. 5EU/mg。從兩個運 行產生的藥物物質的內毒素水平遠低于該最大值。運行A和B分別僅為規格限度的3. 5% 和 8. 7%〇
[0095] 表8 :LAL顯色的內毒素分析比較
[0096]
[0097] *3號運行顯示了CaptpAdhere負載調節緩沖液的內毒素測量。
[0098] 以小規模整合的運行A和B獲得的DAS181純化回收產率分別為45. 9%和55. 0% (表89。總產率大大地受通過細胞透化作用和澄清回收的DAS181釋放的性能的影響，且在 色譜操作期間損失最小量的DAS181材料。預計的（projected)步驟產率不滿足初級回收， 但高于純化操作所預計的。總計，初級回收后，DAS181回收率減少了 3. 9±1. 5%。
[0099] 表9:整合的運行A和B DAS181回收產率與預計步驟產率
[0100]
[0101」邁仃A和B的進一步純化的產物的回
嘆卒為93. 1土L5%。這是相對t1虧和2 號運行中使用的替代性進一步純化的產物的產物（產生了 89. 9±2. 4%的回收率）的改進。 UF/DF1號操作的產率低于所有小規模整合的運行預期的產率~88-90%。對于全部色譜 操作，預計的步驟產率都是領先的。
[0102] 結論是在純度、純化回收產率和活性方面，用改進的參數優化的所推薦的DAS181 3期純化過程產生了與DAS181參考相當或在一些情況下好于DAS181參考的藥物物質。用 CaptoAdhere色譜代替RP色譜校正了以前所經歷的低RP-HPLC純度問題。
[0103] 實施例3
[0104] 優化用于去垢劑增溶蛋白純化的試劑的參數
[0105] 測定和比較去垢劑增溶方案的不同試劑的不同參數用于基于蛋白產率的測定的 優化。首先，選擇評價多種Triton濃度與有限范圍的SDS濃度組合用于DAS181回收產率。 另外，磷酸鈉與Η)ΤΑ的多種組合在pH6下預處理對通過使用7%TritonX-100和0. 1% SDS的去垢劑透化作用的DAS181回收的影響。另外，確定PEI處理的持續時間是否影響在 室溫下保持時間延長多達5天期間的DAS181的特性。最后，評估在4°C下儲存的DAS181的 澄清的去垢劑透化裂解物的穩定性并用于在大規模生產的SP色譜之前確定可允許的保持 時間。
[0106]
[0107] 去垢劑濃度分析：將發酵物等分并經歷去垢劑增溶純化。
[0108] 以不同濃度添加去垢劑并在30°C下攪拌6小時。使上清液經歷陽離子交換HPLC。 確定峰A、C和F的相對峰面積（總峰面積的％ )。通過ECX總峰面積與已知濃度的標準的 比較確定DAS181濃度，并將該濃度標準化為按通過唾液酸酶測定所確定的發酵收獲產率 以產生回收率（收獲的％)。通過添加1〇%ΡΕΙ(在50mM磷酸鉀、200mMNaCl中，最終pH 6. 0)澄清選擇去垢劑溶解的樣品至達到0. 48%的最終PEI濃度。使上清液經歷濁度測量 和進一步的純化。
[0109] 磷酸鈉和EDTA預處理分析：
[0110] 誘導24小時后收獲發酵物。以不同的濃度組合添加七水合磷酸氫二鈉和在pH 8. 7下的無酸EDTA。使樣品經歷去垢劑增溶方案。將上清液經歷陽離子交換HPLC。確定 峰A、C和F的相對峰面積（總峰面積的％)。通過總峰面積與已知濃度的標準的比較確定 DAS181濃度，并將該濃度標準化為發酵收獲產率以產生回收率（收獲的％ )。
[0111]PEI澄清的透化裂解物濃度的評價：
[0112] 誘導24小時后收獲發酵物。使樣品經歷去垢劑增溶方案。添加PEI至0. 5%的最 終濃度。以不同的時間間隔從發酵罐取出樣品。使上清經歷0D測量和進一步的純化方法。
[0113]PEI澄清的透化裂解物儲存時間的評價：在本研究中使用的起始材料是來自發酵 運行的進一步純化的透化裂解物。這些樣品經歷進一步的純化方法。
[0114]MM.
[0115] 去垢劑濃度分析：在去垢劑增溶方案期間以不同的濃度組合添加去垢劑Triton 和SDS。在表8中總結了DAS181產率的結果。
[0116] 表8 :用Triton和SDS的不同的濃度組合處理后的DAS181釋放
[0117]
[0118] 隨著TritonX-100濃度從1%增加到8%，不存在隨SDS濃度變化的DAS181產 率的明顯趨勢，表明盡管SDS自身是關鍵因素，SDS并不作為其濃度因素影響產率。在8% TritonX-100下，回收率存在明顯增加，標準偏差較小，跨越所有SDS濃度的平均產量回收 率為73%。因此研究了更高的濃度。注意到了來自5-9%TritonX-100的穩定的產率。 在濃度大于9%TritonX-100下產率開始降低。還注意到在較高SDS濃度下DAS181產率 降低的趨勢。在取樣中觀察到包含>9%TritonX-100的去垢劑處理比具有較低Triton X-100濃度的樣品更粘。
[0119] 盡管在測定中存在變化，用PEI處理的樣品顯示了在5-9%的TritonX-100濃度 下的一致產率。用10%及更高的TritonX-100觀察到了產率輕微的下降。從利用增加的TritonX-100濃度的方案分離的樣品中觀察到了整體增加的濁度。（表10)。
[0120] 表10 :用于不同濃度的去垢劑組合在PEI處理后的DAS回收率
[0121]
[0122] 結論是最佳的TritonX-100濃度為在5-8%之間，證明過程對Triton濃度耐受。 DAS181 產率從 5%到 10%TritonX-100 是一致的，而濁度從 5%到 8%TritonX-100 是一 致的。這些數據支持TritonX-100以5-8%的范圍與0. 05-0. 2%SDS組合使用。
[0123] 磷酸鈉與EDTA預處理分析：
[0124] 數據顯示了，隨著七水合磷酸氫二鈉與EDTA組合濃度增加，DAS181釋放總體增 加（表11)。另外，在pH6透化作用前未接受預處理的對照樣品中觀察到很少乃至沒有的 DAS181釋放。在pH5下用選擇的50mM磷酸鈉和100mMEDTA的預處理濃度的預處理具有 與在pH6下的相同條件下大約相同的DAS181回收百分比（表11)。
[0125] 表11 :不同的去垢劑透化劑對DAS181回收率的影響
[0126]
[0127] 結論是，磷酸鈉與EDTA的預處理組合是允許釋放DAS181的pDAS181大腸桿菌的 有效的TritonX-100和SDS透化作用所需要的。總體上，這些觀察表明了去垢劑透化作用 在寬范圍的磷酸鈉及Η)ΤΑ濃度、pH條件及孵育時間內是穩健的。選擇在pH6下50mM磷 酸鈉及100mMΗ)ΤΑ的組合作為最佳的預處理濃度。
[0128]PEI澄清的透化裂解物的評價：
[0129] 在室溫下保持的來自PEI處理的澄清的上清液隨延長的保持時間濁度增加（表 12)。在具有最短的PEI處理時間的樣品中濁度的增加最大，且在具有較長的PEI處理時間 的樣品中濁度變化最小；確認了較長的PEI處理時間導致具有減少的沉淀形成的澄清的材 料。PEI處理>7小時導致24小時內最小的濁度增加，且PEI處理>20小時導致直至為120 小時的測量最長持續時間內最好的穩定性（0D600nm〈2. 0)。PEI處理〈6小時導致在120小 時濁度為〇D600nm>3. 0,且當與PEI處理>7小時相比時在24小時濁度輕微地增加。
[0130] 在PEI處理和離心后立即確定DAS181回收率。回收率范圍為從81%到95% (表 4和圖2)。大多數樣品點具有在83%到89%之間的一致回收率。通過快速CEX-HPLC測定 測量的DAS181變體的比率（峰A、C和F)在測定誤差內是恒定的（表13)。對所有PEI處 理，主DAS181峰（A)在79. 93%和81. 63%之間。峰C在10. 20%和12. 06%之間，且峰F 范圍在7. 81%和8. 91%之間。這些數據顯示長PEI處理時間不對DAS181產物質量產生不 利影響。
[0131] 表12 :PEI處理持續時間和澄清后保持時間對透化裂解物濁度的影響
[0132]
[0133] ND=未確定
[0134] 表13:PEI處理后立即得到的DAS181回收率及DAS181變體水平
[0135]
[0136] 結論是，在室溫下24小