蛋白純化的新穎方法
【專利說明】蛋白純化的新穎方法
[0001] 關于聯邦政府資助的研究的聲明
[0002] 本文公開的本發明部分由政府資助做出，且政府在本發明中擁有某些權 利。特別地，本文公開的本發明的部分部分地根據美國國立衛生研究院給予的合同號 N01-AI-60015C得到資助。 發明領域
[0003] 本發明總體上涉及從細胞培養物獲取細胞內蛋白的新穎方法和試劑。
[0004] 背景
[0005] 圍繞大規模純化蛋白的關注對于生物技術產業是日益重要的問題。許多紊亂已 是蛋白或酶替代療法的主題，所述紊亂包括營養不良性大皰性表皮松解癥（dystrophic epidermolysisbullosa)和溶酶體積紊亂（lysosomalstoragedisorders)諸如戈謝病 (Gaucherdisease)、法布里病（Fabrydisease)和龐貝氏病（Pompedisease)。供應患者 需要的大規模蛋白生產一定是成本敏感的，具有生產效率和出產高質量產品。蛋白純化的 過程是時間漫長的、繁重的和昂貴的。這些缺點大大地影響蛋白替代療法的成本并通常對 醫療保健構成巨大的挑戰。
[0006]蛋白生產主要在細胞內完成，S卩，哺乳動物、細菌或真菌，它們通過插入包含用于 該蛋白的基因的重組質粒被工程化以產生感興趣的蛋白。在復合生長培養基中培養表達感 興趣的蛋白的細胞，該復合生長培養基包含通常由動物血清制劑提供的糖、氨基酸和生長 因子。純化需要從供給細胞的化合物和細胞碎片的混合物分離期望的蛋白以便以高質量純 化足夠的量用作人類治療劑。
[0007] 用于從細胞碎片純化蛋白的程序是漫長和復雜的。取出感興趣的蛋白需要的多個 和重復的步驟大大地降低最終蛋白的產率和質量。在許多情況下，蛋白在純化后必須是功 能性的。
[0008] 在生物學表達系統的細胞內區室中表達的重組蛋白在存在細胞壁的情況下通常 通過機械破碎從表達系統細胞釋放。此類機械方法包括勻漿化、微流化、氮爆、超聲和珠攪 拌方法。其他方法包括添加酶以部分地降解細胞壁組分隨后用滲透劑以誘導周質內含物的 破裂和釋放。結合酶消化和化學處理的這些方法主要用于在革蘭氏陰性細菌中靶向周質間 隙的表達的蛋白。沒有細胞壁的細胞可通過滲透壓而不不添加酶，或通過使用去垢劑或有 機溶劑完全破碎細胞膜來破碎。為了提高效率可組合使用破碎方法。
[0009] 大多數以前的方法僅適用于從周質區室釋放蛋白或導致細胞區室完全破碎。當完 全破碎細胞時，DNA可從亞細胞區室被釋放并導致高粘性液體的形成。DNA可被剪切或酶促 降解以降低粘性并使在大規模生產期間處理工藝流體流（theprocessfluidstream)成 為可能。這些步驟成功地用于醫藥級蛋白的生產；然而，每個處理步驟增加了制造的復雜 性，時間和成本。
[0010] 發明概述
[0011] 本公開內容提供了新穎方法和試劑，所述新穎方法和試劑涉及從存在于培養基中 的細菌細胞特別是大腸桿菌（E.coli)純化感興趣的細胞內蛋白的方法，而（i)沒有從培養 基取出細胞，（ii)不使用細胞的機械破碎或不使用酶降解細胞壁；和（iii)沒有將細胞群 壓實成濃縮的沉淀形式。
[0012] 所公開的方法用于通過添加透化細胞用于釋放重組蛋白的預定組合無機鹽和去 垢劑來釋放細胞內的重組蛋白，而不導致細胞的全部破碎，從而減少DNA釋放的量和產生 的增加的粘度。
[0013] 可通過在選擇性沉淀后的離心步驟從可溶的重組蛋白純化出剩余的細胞碎片。
[0014] 該方法可通過一系列步驟完成，所述步驟包括在完成細胞培養（即，發酵）后將適 當的化學試劑添加到生物反應器。以逐步的方式將這些化學試劑添加到培養物。還添加試 劑以便實現該試劑的特定濃度。該方法需要化學試劑在溶液中的存在規定的時間量。
[0015] 該方法不需要從細胞培養物分離細胞。另外，它不需要在添加試劑（"釋放試劑"） 前除去生長培養基。該方法不利用機械破碎裂解細胞。
[0016] 這樣做，該方法降低了制造的復雜性、時間和成本，同時由于減少的DNA釋放而增 加了穩健性。
[0017] 本文件提供了用于從表達感興趣的蛋白的細菌細胞或真菌釋放感興趣的蛋白的 方法。該方法包括：(a)提供表達感興趣的蛋白的細胞的培養物（例如，表達感興趣的蛋白 的細胞和細胞已被在其中培養的生長培養基）；(b)使細胞培養物與無機鹽相接觸（例如， 通過向培養物添加包含無機鹽的組合物）；(c)使包含添加的無機鹽的培養物保持至少10 分鐘；（d)使包含添加的無機鹽的培養物與螯合劑接觸（例如，通過向培養物添加包含螯合 劑的組合物）；（e)使包含添加的無機鹽和添加的螯合劑的培養物保持至少10分鐘；（f)任 選地將包含添加的無機鹽和添加的螯合劑的培養物的pH調整至在4和9之間的pH; (g)在 pH調整后使包含添加的無機鹽和添加的螯合劑的培養物保持至少15分鐘；(h)使包含添加 的無機鹽和添加的螯合劑的培養物與去垢劑接觸；（i)使包含添加的無機鹽、添加的螯合 劑和添加的去垢劑的培養物保持至少1小時；（j)任選地使包含添加的無機鹽、添加的螯合 劑和添加的去垢劑的培養物的溫度降低；(k)使包含添加的無機鹽、添加的螯合劑和添加 的去垢劑的培養物與沉淀劑接觸；（1)使包含添加的無機鹽、添加的螯合劑、添加的去垢劑 和添加的沉淀劑的培養物保持至少1小時；和（m)使包含添加的無機鹽、添加的螯合劑、添 加的去垢劑和添加的沉淀劑的培養物經歷除去大部分的（例如，至少90%)細胞碎片的方 法。該方法不包括選自由以下組成的組的至少兩個步驟：（i)機械破碎細胞，（ii)在添加 前除去全部或基本上全部的培養基，和（iii)添加消化細胞壁材料的酶。在一些情況下，該 方法不包括以下的任何一個：（i)機械破碎細胞，（ii)除去全部或基本上全部的培養基，和 (iii)添加消化細胞壁材料的酶。以上方法還可包括除去部分或基本上全部的培養基。
[0018] 在其中使用了無機鹽的以上方法中，該無機鹽可以是磷酸鈉、硫酸銨和氯化鈉。在 其中使用了去垢劑的以上方法中，該去垢劑可以是Triton、SDS、CHAPS3、NonidetP40、 η-辛基葡萄糖苷和吐溫-20。以上方法還使用可選自Triton、SDS、CHAPS3、NonidetP40、 η-辛基葡萄糖苷和吐溫-20的兩種去垢劑的混合物。以上方法還使用了沉淀劑，該沉淀劑 可以是ΡΕΙ、和銨鹽、和聚乙二醇、TCA和乙醇。
[0019] 在一些情況下，表達期望的蛋白的細胞是大腸桿菌。以上方法使用細菌細胞，其為 革蘭氏陰性菌。期望的蛋白是細胞內蛋白（即，其不是從細胞分泌的）。感興趣的蛋白可以 是DAS181。
[0020] 在所有以上方法中，保持包含無機鹽的培養物的步驟發生至少20分鐘。在所有以 上方法中，保持包含無機鹽和螯合劑的培養物的步驟可以持續至少15分鐘至少30分鐘、45 分鐘或1小時或在30min和1小時之間。
[0021] 在所有以上方法中，保持包含無機鹽、螯合劑和去垢劑的培養物的步驟可發生至 少1小時、至少30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、小時6 小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時或5-13小時。在所有以上方法中，保 持包含無機鹽、螯合劑、去垢劑和沉淀劑的培養物的步驟可發生至少1小時、至少30分鐘、 1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、6小時、7小時、8小時、9小時、 10小時、11小時、12小時或5-13小時。
[0022] 步驟可在混合物在25-35Γ優選地30°C時發生。在添加沉淀劑之前，混合物的溫 度可被降到低于25°C，例如在25°C和20°C之間或降低到21°C和23°C之間。
【附圖說明】
[0023] 圖1是新穎蛋白釋放方案的實施方案的流程圖。
[0024] 圖2是需要勻漿化裂解的蛋白釋放方法相比于新穎蛋白釋放方法（"去垢劑增 溶"）的比較。
[0025] 圖3A-3E是勻漿化裂解方案和去垢劑增溶方案的SDSPAGE分析。圖3A和B描述 了由勻漿化方案（圖3A)和去垢劑增溶方案（圖3B)分離的蛋白的考馬斯檢測。圖3C和D 描述了由勻漿化方案（圖3C)和去垢劑增溶方案（圖3C)分離的蛋白的銀檢測。圖3E是 用銀檢測的SDS-PAGE比較凝膠。在圖3A中，泳道1-10分別包含：分子量標志物、澄清的勻 漿、SP流-通、SP洗脫物、HIC洗脫物、PostHICTFF、RPC負載、RPC洗脫物，和DAS181Ref Std750-0406-002。在圖3B中，泳道1-10分別包含：分子量標志物、PEI澄清的去垢劑、 去垢劑SP負載、去垢劑SP流-通、去垢劑SP洗脫物、去垢劑HIC洗脫物、去垢劑Post-HIC TFF、RPC負載、RPC洗脫物和DAS181參考標準750-0406-002。在圖3C中，泳道1-10分別 包含：分子量標志物、澄清的勻漿、SP流-通、SP洗脫物、HIC洗脫物、PostHICTFF、RPC洗 脫物，和DAS181RefStd750-0406-002。
[0026] 圖4是去垢劑增溶的優化方法和蛋白純化的步驟的流程圖。
[0027] 圖5A-F是運行A和B的蛋白的分析。圖A-C分別是運行A的去垢劑增溶產率的考 馬斯染色、蛋白印跡和銀染分析。用于這些分析的泳道1-10分別為如下：MW標志物、SP洗 脫物（Ferm20110523F2)、HICFT、UF/DF1 號池、CaptoAdhereFTpH7.7、滴定的0&口七〇 AdhereFTpH5.0、藥物物質和DAS181Ref.Std。圖D-F分別是運行B的去垢劑