增溶產率 的考馬斯染色、蛋白印跡和銀染分析。用于這些分析的泳道1-10分別為如下：MW標志物、 SP洗脫物（Ferm20110613F2)、HICFT、UF/DF1 號池、CaptoAdhereFTpH7. 7、滴定的 CaptoAdhereFTpH5.0、藥物物質和DAS181 參考標準Lot46-012。
[0028] 圖6A和6B是DAS181純度的SDS-PAGE分析。在圖4A中顯示：泳道1是麗標志 物，泳道2是藥物物質Ferm20110523F2,泳道4&5是藥物物質Ferm20110613F2,且泳道6 是DAS1812期參考標準Lot46-012。在圖4B中顯示蛋白的不同濃度：8-20μg。
[0029] 圖7A-7C示出來自以下的DAS181的RP-HPLC比較：整合的運行A、整合的運行B和 DAS181參考標準。
[0030] 圖8A-8C示出來自以下的DAS181的CEX-HPLC比較：整合的運行A、整合的運行B 和DAS181參考標準。
[0031] 圖9是經過幾周儲存的DAS181穩定性的SDS-PAGE分析。
[0032] 詳述
[0033] 本文描述的方法通常可被用于從細菌細胞特別是大腸桿菌釋放細胞內蛋 白。本文的實施例涉及從大腸桿菌釋放DAS181 (Malakhov等人，Antimicrob.Agents Chemother.，1470-1479(2006))。DAS181是融合蛋白，該融合蛋白包含來自人類雙調蛋 白的肝素（糖胺聚糖，或GAG)結合結構域，其通過其N-末端與粘放線菌（Actinomyces Viscosus)的催化結構域的C-末端融合（例如，在SEQIDN0:1(無氨基末端蛋氨酸）和 SEQIDN0:2 (包括氨基末端蛋氨酸）中列出的氨基酸序列）。本文描述的基因工程化細胞 包含一種或更多種編碼DAS181蛋白的核酸。適合體內產生DAS181或重組產生本文描述的 任何多肽的細胞可以是細菌或真菌起源的。
[0034] 可使用表達載體實現在細胞（例如，細菌細胞）中蛋白的過表達。表達載體可以是 自主的或整合的。可以以表達載體諸如質粒的形式將重組核酸（例如，編碼DAS181的重組 核酸）引入到細胞中。重組核酸可以以染色體外形式維持或可將其整合入染色體DNA。表 達載體可包含編碼在選擇條件下細胞存活所需要的蛋白的選擇標志物基因以允許檢測和/ 或選擇轉化了期望的核酸的那些細胞。表達載體可還包括自主復制序列（ARS)。
[0035] 轉化的細胞（S卩，細菌細胞）可通過使用適當的技術來選擇，該技術包括但不限 于，轉化后在需要的生化產物不存在下培養營養缺陷型細胞，選擇和檢測新表型，或在抗生 素的存在下培養，該抗生素在包含在轉化子中的抗性基因不存在下對酵母是有毒的。還可 通過將表達盒整合入通過例如DNA印跡或PCR分析來評估的基因組來選擇和/或驗證轉 化子。在將載體導入感興趣的靶細胞前，載體可在如以上所述的細菌細胞諸如大腸桿菌 (E.coli)中生長（例如，擴增）。可通過本領域已知的導致從細菌環境純化載體DNA的任 何方法從細菌細胞中分離載體DNA。純化的載體DNA可大量地用苯酚、氯仿和乙醚提取以保 證在質粒DNA制劑中不存在大腸桿菌蛋白，由于這些蛋白可對哺乳動物細胞是有毒的。
[0036] 可用于多肽的小規模或大規模產生的表達系統包括但不限于，微生物諸如用包含 核酸分子的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌（例如，大腸桿菌）， 和用包含核酸分子的重組真菌表達載體轉化的真菌（例如，釀酒酵母（S.cerevisiae))。
[0037] 通常，對于感興趣的蛋白通過細菌（例如，大腸桿菌）重組細胞的體內產生，細胞 可在包含可同化的（assimilatable)氮源和碳源的水性營養培養基中，通常地在浸沒的需 氧條件下（震蕩培養、浸沒培養等）培養。使用培養基中的蛋白組分、摻入培養基的緩沖液 或根據需要通過外部添加酸或堿，可將水性培養基維持在4. 0 - 8. 0(例如，4. 5、5. 0、5. 5、 6.0或7.5)的PH。營養培養基中的適合的碳源可包括：例如，碳水化合物、脂質和有機酸諸 如葡萄糖、鹿糖、果糖、甘油、淀粉、植物油、石化衍生的油（petrochemicalderivedoils)、 琥珀酸鹽/酯、甲酸鹽/酯等等。適合的氮源可包括，例如，酵母提取物、玉米漿、肉提取物、 蛋白胨、蔬菜餐、酒糟可溶物（distillerssolubles)、干酵母等以及無機氮源諸如硫酸銨、 磷酸銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸等。
[0038] 有利地組合使用的碳源和氮源，不需要以純的形式使用，由于包含痕量的生長因 子和大量礦物營養的低純材料也適合使用。可將期望的礦物鹽諸如磷酸鈉或磷酸鉀、氯化 鈉或氯化鉀、鎂鹽、銅鹽等添加到培養基。可根據需要以痕量添加消泡劑諸如液體石蠟或植 物油，但通常不需要。
[0039] 可在促進最佳生物量和/或酶滴度產率的條件下進行表達感興趣的蛋白的重組 細胞（例如，大腸桿菌細胞）的培養。此類條件包括，例如，分批培養、分批補料（fed-batch) 培養或連續培養。另外，條件參數的改變還可促進DAS181蛋白的最佳生物量和/或酶滴度 產率。此類條件包括，例如，培養基中的甘油濃度和高P〇2。對于大量生物量的產生，可使用 浸沒的需氧培養方法，然而少量可在搖瓶中培養。對于大罐中的產生，可使用許多較小的接 種罐以使接種物擴大至足以最小化生產容器中的延遲時間的高水平。用于產生生物催化劑 的培養基通常在接種細胞前滅菌（例如，通過高壓滅菌法）。可通過機械裝置在氣泡反應器 中同時添加無菌空氣或通過單獨地添加空氣實現培養物的通氣和攪拌。可在培養期間在例 如生物反應器中使用較高P〇2 (溶解氧）以促進最佳的生物量。還可用其促進生物量培養 物中最佳的活性蛋白表達。實施此類發酵參數，包括較高局部氧分壓和逐步地甘油消耗，可 導致感興趣的蛋白的增加的產率。
[0040]去垢劑增溶方法
[0041] 原位去垢劑透化作用
[0042] 在足夠的培養以供期望的蛋白表達后，通過停止向反應器中的進料添加和氣流， 以及通過降低攪拌速度100至250rpm收獲培養物。將溫度設定在15°C至45°C的范圍以準 備透化作用步驟。在一些實施方案中，可將溫度設定在30°C。這在本公開內容中還被稱為 預處理步驟。可將無機鹽（例如，磷酸鈉、硫酸銨和氯化鈉）添加至在l〇-l〇〇mM范圍的最 終濃度。在一些實施方案中，無機鹽的最終濃度為50mM。允許將溶液混合至少10分鐘或至 少20分鐘。添加螯合劑諸如乙二胺四乙酸（EDTA)至在50-200mM的范圍的最終濃度并混 合至少10分鐘或至少20分鐘。在一些實施方案中，將EDTA添加至100mM的最終濃度（例 如，50nM-250nM)。隨后可將pH調整至5. 0-6. 0(例如，使用磷酸）。在一些實施方案中，將 pH調整至6。邊混合（例如，以400-450rpm的混合速度）邊將材料孵育至少10分鐘（例 如，在30分鐘至180分鐘或更長的范圍的時間量）。在該方法的一些實施方案中，將材料 孵育60分鐘。將去垢劑（例如，Triton、SDS、CHAPS3、NonidetP40、η-辛基葡糖苷和吐 溫-20)或去垢劑的組合例如十二烷基磺酸鈉（SDS)Triton-X100添加至混合物。Triton-X 100可在2-15%的范圍與0.01-1%SDS-起組合使用。在一些實施方案中，隨后將10% SDS溶液添加至0.1 %的最終濃度并同時將Triton-X100添加至7%的最終濃度。可將溶 液在15-45°C的范圍的溫度以中等速度混合1-5小時的范圍的時間量。在一些實施方案中， 溶液在30°C以中等速度混合3小時。
[0043] 澄清
[0044] 在去垢劑組合中孵育后，將混合物溫度降低至22°C。隨后將百分之十（10% )PEI、 pH6. 0儲備溶液添加至0. 5%的最終濃度。可在22°C下將溶液混合范圍在6-24小時的時間 量。在一些實施方案中，在22°C下將溶液混合6-12小時。在該方法的另一個實施方案中，在 22°C下將溶液混合6-8小時的目標。隨后通過使用SharpiesAS-14(進料流速（feedflow rate) :lL/min)的連續流動離心使混合物澄清。在T= 0下測量混合物的濁度（0D600nm)。 在開始蛋白純化過程前，混合物可任優選地在環境溫度下保持過夜。
[0045] 在以上去垢劑增溶方法后，產物可經歷進一步的純化。 實施例
[0046] 將在以下實施例中進一步描述本發明，該實施例不限制權利要求書中描述的本發 明的范圍。
[0047] 本發明是無需機械破碎細胞或通過外源添加的酶酶促降解細胞壁的方法而進行 的新穎蛋白純化方案。完成它還無需從細胞培養物中分離細胞且另外不需要從培養基取出 細胞。
[0048] 優化本發明新穎增溶方案以出產高質量的和穩定的感興趣的蛋白DAS181。本文定 義了該新穎蛋白純化的優化。本方案還是相比于本領域已知的蛋白純化的普通方式即勻漿 化，具有益處的方案。比較感興趣的蛋白DAS181通過勻漿化純化與通過新穎增溶方案純化 后的質量、穩定性和完整性。本發明蛋白純化方案在指定的時間窗口以指定濃度利用試劑。 在下面討論這些參數的優化。
[0049] 實施例1
[0050] 與去垢劑增溶相比由勻漿化產生的蛋白產率和質量
[0051] 進行了廣泛的研究以優化用于從細胞原位釋放感興趣的蛋白DAS181的增溶，作 為包括機械勻質化的方案的改進的替代。與勻漿化比較增溶將通過允許從細胞釋放DAS181 而沒有細胞分離、細胞洗滌、重懸和勻漿化的步驟來減少處理時間。實施例1的細節描述了 與勻漿化方法