針對與肝素復合的抗凝血酶β的單克隆抗體的制作方法
【專利說明】針對與肝轟復合的抗凝血酶P的單克隆抗體
[0001] 與巧關申請的香叉參考 本申請作為PCT國際專利申請于2014年3月14日提交，并且要求于2014年3月14 日提交的美國臨時專利申請號61/784, 590的優先權，所述專利申請的整個公開內容在此 整體引入作為參考。
[0002] 序列表提乂 本申請包括作為txt文件W電子形式的序列表，所述txt文件名稱為"SEQUENCE-LIST ING-17207. 0006W0U2"，于2014年3月14日創建，并且具有65. 1千字節（邸）的大小。txt 文件"沈QUENCE-LISTING-17207. 0006W0U2"的內容引入本文作為參考。
[0003]背景 血友病領域中的目前未滿足的醫學需要主要是：（〇具有抑制劑的血友病患者（~30% 的血友病患者）的治療；和（2)長效和有效的凝血因子（FVIII/FIX)和/或其替代（旁路藥 物）（WFH報道2012,Paris)。用于治療具有抑制劑的血友病患者的最廣泛使用的旁路藥物 是rFVII，其具有重大缺點例如致血栓性的危險、血漿中的短半衰期和高生產成本。針對抗 凝因子例如組織因子蛋白質抑制劑（TFPI)、APC魄化蛋白C)和抗凝血酶（AT)的抗體代表 新的治療范例。運些抗體不僅繞過或降低具有抑制劑的血友病患者中關于FVIII或FIX凝 血因子的需要，還顯示出更長的血漿半衰期（其降低給藥頻率)，并且因此增加患者依從性。 迄今為止，存在處于臨床前開發或研究階段的幾種基于抗體的促凝藥物，例如抗TFPI和抗 APC。
[0004] AT是人血漿中的主要抗凝劑。它抑制在凝血途徑中起作用的凝血酶、FXa及其他 絲氨酸蛋白酶。它由432個氨基酸組成，由肝臟肝細胞產生，并且具有=天的長血漿半衰 期（Collen，Schetz等人1977)。AT的氨基酸序列是非常保守的，并且在牛、綿羊、兔、小鼠 和人中的同源性是84%-89% (Olson和Bjork1994)。盡管AT的主要生理學祀是凝血酶和 FXa,但AT還將FIXa、FXIa、FXIIa W及FVIIa抑制至更少程度。AT連同肝素一起發揮其抑 審IJ。在肝素的存在下，凝血酶和FXa被AT的抑制速率增加3至4個數量級，分別為7-11 X 1〇3 M Is 1至 1. 5 - 4X107 M Is 1，W及 2. 5X1〇- 3 M-1 S-1至 1. 25 -2. 5M Is 1(Olson, Swanson等人 2004)。
[0005] 與分別在初始階段和放大階段單獨抑制凝血的TFPI和APC不同，AT在初始和放 大階段兩者都對凝血發揮其抑制。因此，阻斷AT可W具有比阻斷單獨的TFPI或APC更有 力的促凝效應。減少的AT水平和活性已顯示與人中增加的血栓形成關聯。具有AT缺乏的 患者趨于顯示復發性靜脈血栓形成和肺栓塞（vanBoven和Lane1997)。此外，純合AT敲 除小鼠死于胚胎期，具有極端高凝狀態（Ishiguro,Kojima等人2000)。近期研究顯示在尾 夾出血模型中，其中AT顯著降低50%的雜合AT敲除hema小鼠具有更少的失血和增強的凝 血酶生成（BolIiger，Szlam等人 2010)。
[0006]AT是具有基于在Asnl35上的差異糖基化的兩種同種型ATa和ATP的糖蛋白 (Bjork1997)。ATP缺乏在Asnl35處的糖基化，并且是代表10%的人血漿AT的次要糖同 種型。Asnl35定位在與初始肝素附著位點郵鄰，并且構成在別構活化和D螺旋延伸后的延 伸肝素結合位點的部分（dela化uz，化irajpuri等人2006)。在Asnl35處的大尺寸聚糖 的缺乏W兩種方式顯著影響AT0活化：1)在肝素結合后抑制FXa和FIXa所需的更快速的 別構活化；和2)關于通過橋連機制抑制FXa和凝血酶的更高親和力的肝素結合的額外可 接近的結合位點。事實上，在生理學鹽濃度下，血漿衍生的ATPW36+/- 3皿的Kd與肝素 結合，而ATaW500+/- 50nm的Kd與肝素結合（TurkIV.等人，1993)。ATP對于肝素的 更高親和力導致其優先分布至內皮下層，其富含肝素樣結構-糖胺聚糖。因此，ATP提議 在血管損傷部位處的FXa和凝血酶抑制中起主要和有力作用（Carlson和Atencio1982 ; McCoyAJ，PeiXY.等人 2003JurkB，化ieditisI.等人 1997;WitmerMR，化ttonMW. 1991;化ebeliusS，等人1996)。ATP相對于ATa的重要性和更強的效力也在臨床研究 中得到報道。在患者中，在肝素結合中缺陷的AT純合突變的嚴重性通過AT的0形式得到 改善（Martinez-Martinez,化varro-Fernandez等人2012)。在另一項研究中，AT的界線水 平（~70%的正常AT抗原和活性)被血漿中的20% ~ 30%ATP補償（Bayston，Tripodi等人 1999)。
[0007] 概沐 提供了針對人AT0H(與肝素和/或肝素樣結構復合的AT0 )的單克隆抗體。在至少 一個實施方案中，抗AT0H單克隆抗體顯示出結合與肝素復合的AT0。
[0008] 在其他實施方案中，針對人ATPH的單克隆抗體可W進行優化，例如W具有增加 的親和力或增加的功能活性。還提供的是特異性表位，其可W在人AT0H上，并且由經分離 的單克隆抗體結合。進一步提供的是編碼其的經分離的核酸分子。
[0009] 還提供的是包含抗AT0H單克隆抗體的藥物組合物，W及遺傳性和獲得性凝血缺 乏或缺陷例如血友病A和B的治療方法。
[0010] 還提供的是通過給有此需要的患者施用抗AT0H單克隆抗體，用于縮短出血時間 的方法。還提供的是用于產生結合人AT0H的單克隆抗體的方法。
[0011] 附圖簡沐 技術人員應當理解下文描述的附圖僅用于舉例說明性目的。附圖不預期W任何方式限 制本文教導或權利要求的范圍。
[001引圖1顯示了與肝素結合的ATP和ATP的各種結合結構域的圖示。
[001引圖2A-2C顯示了AT0如何通過一個N聚糖的缺乏與ATa區別。
[0014] 圖3A-3D顯示了AT0比ATa與肝素更快速的結合和更有力的抑制。
[0015] 圖4A顯示了生物素化的MT和rAT在Fxa生成的抑制中起作用（圖4A)。圖4B-4C 顯示了通過隧菌體展示的抗體發現的各種策略。
[0016] 圖5顯示了用于鑒定能夠功能抑制ATP::肝素的抗體的篩選方法。
[0017] 圖6A和她分別顯示了抗體TPP-2009(分別為沈QIDNO: 1和沈QIDNO: 2)、 了口口-2015(分別為沈9 10側:3和沈9 10側:4)、1口口-2016(分別為沈9 10側:5和沈9 10側:6)、1??-2019(分別為沈9 10側:7和沈9 10側:8)和1??-2803 (分別為沈9 10 NO:9和SEQIDNO: 10)的輕鏈結構域和重鏈結構域的氨基酸序列比對。
[0018] 圖7A-7C顯示了通過Biacore(圖7A)和化ISA(圖7B)測試測定的抗體結合特異 性，W及與人At0H的抗體結合親和力（圖7C)。
[0019] 圖8A是TPP抗體對人HEM-A血漿中的凝血酶生成的作用的圖解表示，并且舉例說 明抗體存在增加人HEM-A血漿中的峰凝血酶生成。
[0020] 圖8B是顯示抗體縮短人化m-A血漿W及滲入At 0或At a的人AT缺乏血漿中的 凝血時間的表。
[0021] 圖9是在肥M-A小鼠中的抗體TPP2009的PK的圖解表示，使用W0. 3、3和30mg/ kg的IV給藥，S只小鼠/時間點您過21天10個時間點），W及相關PK參數。
[002引 圖IOA和IOB顯示了關于化HiA中的尾靜脈橫切（TVT)模型的實驗方案，W及化HiA小鼠中的TVT模型中的抗體TPP-2009的功效。圖IOB顯示了抗體TPP-2009在化HiA小鼠 的尾靜脈橫切（TVT)模型中具有有力功效。
[002引圖IlA和IlB顯示了用/不用肝素復合的天然ATP(圖11A)、化及與肝素結合的 完全活化的抗體TPP2009(圖11B)及其預測的表位結構的=維結構的分子模型。螺旋D在 肝素結合B后延伸。
[0024] 圖12顯示了使用FXa活化凝血測定，TPP2803顯示出在正常人血漿和血友病患者 血漿中的凝血時間的劑量依賴性縮短。CT:凝血時間，HEM-A:血友病A血漿。
[002引圖13顯示了肝素化兔出血模型的實驗設計；實驗組：媒介物，PBS ;陽性對照，硫酸 魚精蛋白（28mg/kg IV);陰性對照，M14 IgG2 ;處理：30mg/kg ;TPP2803,3mg/kg ;TPP2803， 30mg/kg0
[0026] 圖14.顯示了在肝素化兔出血模型中，在LMWH和化合物施用前和后，對照和 TPP2803對出血時間的作用。
[0027] 圖15.顯示了對照和TPP2803對5出血時間的作用顯著不同于PBS(p^O. 05; T檢驗)。
[002引圖16.顯示了在LMWH和抗體施用前和后，對照和TPP2803對失血的作用。（顯著 性通過T檢驗)。
[0029] 詳沐 本公開內容提供了抗體包括單克隆抗體及其他結合蛋白，其與活化形式的ATP特異 性結合，但顯示出針對幼稚的（na'ive)或活化的ATa形式相當少的反應性或無反應性，。
[0030] 定義 為了解釋本說明書的目的，應用下述定義。在下文闡述的任何定義與該單詞在任何其 他文件，包括引入本文作為參考的任何文件中的使用沖突的情況下，下文闡述的定義應始 終為準，用于解釋本說明書及其相關權利要求的目的，除非明確意圖相反含義(例如在其中 該術語最初使用的文件中）。
[0031] 適當時，W單數使用的術語還包括復數，并且反之亦然。"一個/種"在本文中的 使用意指"一個或多個/ 一種或多種"，除非另有說明或當"一個或多個/ 一種或多種"的 使用明確不適當時。"或"的使用意指"和/或"，除非另有說明。"包含（comprise)"、"包 含（comprises)"、"包含（compriSing)"、"包括（incIude)"、"包括（incIudes)"和"包括 (including)"的使用是可互換的，并且是非限制性的。術語"例如（suchas)"、"例如（for example)"和"例如（e.g.)"也不預期是限制性的。例如，術語"包括"應意指"包括但不限 于"。
[003引如本文使用的，術語"約"指提供的單位值的+/- 10%。如本文使用的，術語"基本 上"指顯示出目的特征或特性的總計或近似程度的定性條件。生物學領域的普通技術人員 應當理解生物學和化學現象很少巧日果有的話）達到或避免決定結果，由于影響生物學和化 學組合物和材料的測試、生產和膽存的許多變量，W及由于在生物學和化學組合物和材料 的測試、生產和膽存中使用的儀器和設備中的固有誤差。術語基本上因此在本文中用于捕 獲在許多生物學和化學現象中固有的完全性的潛在缺乏。
[003引如本文使用的，術語"AT0 "或"AT0H"指AT的任何變體、同種型和/或物種同系 物，其形式由細胞天然表達并且存在于血漿中，并且不同于ATa。進一步地，如本文使用的， 術語"AT0 "或"AT0H"還可W指與肝素或肝素樣結構復合的ATP的活化形式。
[0034]如本文使用的，術語"抗體"指完整抗體及其任何抗原結合片段（即，"抗原結合部 分"）或其單鏈。該術語包括全長免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)，其是天然存在的或通過 正常免疫球蛋白基因片段重組過程形成的，或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如抗體 片段，其保留特異