C保存。
[007引？0?產物電泳檢測：用質量百分濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠120乂電泳25111血邸染 色lOmin，照膠并記錄。
[0079] S、N導入片段的檢測
[0080] 提取待檢測材料如Xanthinc、Coke;rl76的基因組DNA，采用N基因特異分子標記 N1/N2,按照文獻的方法（Xewis,R.S. ,S.R.Milla,andJ.S.Levin.Molecularandgenetic characterizationofNicotianaglutinosaL.chromosomesegmentsintobaccomosaic virus-resistanttobaccoaccessions.CropSci. 2005, 45:2355 - 2362)進行的PCR擴增。 N1/N2檢測為陽性，則判斷為包含N導入片段，N1/N2檢測為陰性則判斷為未包含N導入片 段。挑選出包含N導入片段的材料，用于估算N導入片段的長度。
[0081] 四、估算N導入片段左端長度
[0082]W感TMV的煙草品種K326為感病對照，W已知包含N基因抗TMV的煙草品種 Samsun順和屯、葉煙為抗病對照；W化4. 06引物對或化3. 50引物對為引物，W待檢測的包 含N導入片段煙草的基因組DNA、感病對照的煙草基因組DNA、抗病對照的煙草基因組DNA 為模板，進行PCR擴增，擴增產物進行電泳檢測；
[008引 PCR反應體系如下：
[0084] DNA個巧扳50打紅/pL 這.忌mL， 10'x.PC'Rbuffer 2.0pL, dNTP備2'5謹 1.2 mU 引物對中的引物10umol/uL備1.思Ml_， Ex-Taq DNA酶貧L 0.3昧，ddl-kO 余
[00財 總體積為20yL;
[0086] 所述的引物對為化4. 06引物對或化3. 50引物對。
[0087] 所用試劑購自寶生物公司。
[008引 PCR反應程序如下：94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸 30秒，運行35個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產物可W在4°C保存。
[0089] ?〇?產物電泳檢測：用質量百分濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠120乂電泳25111血邸染 色lOmin，照膠并記錄，結果如圖1和圖2所示。
[0090] 采用化4. 06引物對進行擴增，抗病對照有39化P擴增產物，感病對照無39化P擴 增產物。表明PCR擴增正常。然后按照如下的標準判斷煙草種質的N導入片段左側的大 小：N1/N2陽性且無391bp擴增產物，判斷該種質N導入片段左側缺失了SeqIDNo.l，缺失 了SeqIDNo. 1表明該種質的N導入片段比抗病對照小。N1/N2陽性且有39化p擴增產物， 判斷該種質N導入片段左側含有SeqIDNo. 1。結果表明：抗TMV的煙草品種Cokerl76無 39化P擴增產物，即在分子標記SeqIDNo. 1運一端Cokerl76的N導入片段比Samsun順 的N導入片段小。抗TMV的煙草品種Xanthinc有391bp擴增產物。即Xanthinc的N導 入片段含有SeqIDNo. 1、在該分子標記位置Xanthinc與抗病對照材料Samsun順無差 異。表明該分子標記可用于鑒定煙草種質的N導入片段長度。
[0091] 采用化3. 50引物對進行擴增，抗病對照有654bp擴增產物，感病對照無654bp擴 增產物。表明PCR擴增正常。然后按照如下的標準判斷煙草種質的N導入片段左側的大小： N1/N2陽性且無654bp擴增產物，判斷該種質N導入片段左側缺失了SeqIDNo. 2,缺失了 SeqIDNo. 2表明該種質的N導入片段比抗病對照小。N1/N2陽性且有654bp擴增產物，判 斷該種質N導入片段左側的含有SeqIDNo. 2。結果表明：抗TMV的煙草品種Cokerl76無 654bp擴增產物，即在分子標記SeqIDNo. 2運一端Coke;rl76的N導入片段比Samsun順 的N導入片段小。抗TMV的煙草品種Xanthinc有654bp擴增產物。即在分子標記SeqID No. 2運一側Xanthinc的N導入片段含有SeqIDNo. 2、在該分子標記位置Xanthinc與 Samsun順的N導入片段無差異。表明該分子標記可用于鑒定煙草種質的N導入片段長度。
[0092] 本發明所述分子標記及引物的序列如下：
[0093]SeqIDNo. 1:
[0094]
[0098]SeqIDNo. 3:
[0099]gatcccacgagtggagca 18
[0100]SeqIDNo. 4:
[0101] tcctcaccaaacccaacttt20
[0102] SeqIDNo. 5:
[0103] ttgagaaccgtccaatttcc 20
[0104] SeqIDNo. 6
[0105] cccct邑a邑tc邑aacaa邑teaa 21
[0106] W上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，運些變 化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等效物界定。
【主權項】
1. 估算煙草N導入片段左端長度的分子標記，其特征在于，所述的分子標記為SeqID No. 1或SeqIDNo. 2所示序列。2. -種估算煙草N導入片段左端長度的PCR擴增方法所用的引物對，其特征在于，所述 的引物對為化4. 06引物對或化3. 50引物對； 所述的化4. 06引物對的序列如下： GL4. 06-F1 :5' -gatcccacgagtggagca-3'， GL4.06-R1:5'-tcctcaccaaacccaacttt-3' ； 所述的化3. 50引物對的序列如下： GL3.50-F1 :5>-ttgagaaccgtccaatttcc-3>， GL3.50-R1 :5>-cccctgagtcgaacaagtcaa-3>。3. -種估算煙草N導入片段左端長度的方法，其特征在于： W權利要求2所述的化4. 06引物對或化3. 50引物對為引物，W待檢測的包含N導入 片段的煙草基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增產物進行電泳檢測，如擴增出對應大小 的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料SamsunNN 無差異；如沒有擴增出對應大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記 位置比抗病對照材料Samsun順短；其中， 當W權利要求2所述的化4. 06引物對進行PCR擴增，如果擴增出39化P大小的DNA片 段，即SeqIDNo. 1所示序列的分子標記，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位 置與抗病對照材料Samsun順無差異；如沒有擴增出39化P大小的DNA片段，則表明被檢測 煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Samsun順短； 當W權利要求2所述的化3. 50引物對進行PCR擴增，如果擴增出654bp大小的DNA片 段，即SeqIDNo.2所示序列的分子標記，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位 置與抗病對照材料Samsun順無差異；如沒有擴增出654bp大小的DNA片段，則表明被檢測 煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Samsun順短。4. 根據權利要求3所述的估算煙草N導入片段左端長度的方法，其特征在于，所述的 PCR的反應體系如下：總體積為20yL; 所述的引物對為化4. 06引物對或化3. 50引物對。5. 根據權利要求3所述的估算煙草N導入片段左端長度的方法，其特征在于，所述的 PCR反應程序：94°C預變性5min;然后進入35個循環：94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延 伸30s;循環結束后72°C延伸IOmin;4°C保存。6. 權利要求3-5任意一項所述的估算煙草N導入片段左端長度的方法在選育煙草抗 TMV品種中的應用。7. 權利要求1所述的估算煙草N導入片段左端長度的分子標記在煙草TMV抗病基因定 位或選育煙草抗TMV品種中的應用。8. 權利要求2所述的估算煙草N導入片段左端長度的PCR擴增方法所用的引物對在煙 草TMV抗病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種估算煙草<i>N</i>導入片段左端長度分子標記、引物及方法。該分子標記為Seq？ID？No.1？或Seq？ID？No.2所示序列。該估算方法是以GL4.06引物對或GL3.50引物對為引物，以待檢測的包含<i>N</i>導入片段的煙草基因組DNA為模板進行PCR擴增，然后電泳檢測，如擴增出對應大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的<i>N</i>導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料Samsun？NN相當；如沒有擴增出，則表明被檢測煙草的<i>N</i>導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Samsun？NN短。該方法可以簡便、快速、高通量地應用于煙草TMV抗病基因定位和選育煙草抗TMV品種中，有利于減少與<i>N</i>基因連鎖的累贅。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105200052
【申請號】CN201510724946
【發明人】劉勇, 李永平, 方敦煌, 黃昌軍, 陳姝敏, 于海芹, 肖炳光
【申請人】云南省煙草農業科學研究院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月30日