估算煙草n導入片段左端長度的分子標記、引物及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，特別是設及估算煙草N導入片段左端長度的分 子標記、引物及方法。本發明還設及擴增該分子標記的引物、W及該分子標記和引物在煙草 TMV抗病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。
【背景技術】
[0002] 煙草花葉病毒病（Tobaccomosaicvirus,TMV)是我國煙草上的重要病害，每年造 成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列。生產上主要采取培育無毒苗、藥劑防治和銷 毀田間病殘體等措施進行防治，在控制TMV的發生流行上取得了一定的效果，但TMV在局部 田塊爆發的情況仍然時有發生，造成較大的經濟損失。因此，種植TMV抗病品種依然是防控 TMV最根本同時也是最經濟有效的手段。抗病品種的推廣需要抗性高、且無產量劣勢和農藝 性狀劣勢的品種。
[0003] 目前煙草的TMV抗源主要來源于煙草野生種屯、葉煙（Nicotianaglutinosa)，其 抗性由一個顯性單基因（腳控制。N基因在1994年被克隆，是植物中克隆的第一個NBS類 抗病基因。N基因抗TMV-U1株系。N基因的基因組序列大小為6656bp，包括5個外顯子和 4個內含子，屬于TIR-NBS-LRR類型抗病基因。N基因的抗病機理為在病毒侵染位點出現過 敏性壞死斑（枯斑），通過誘導產生的細胞過敏性死亡限制TMV在植物體內的移動。在介導 了過敏反應后，煙草植株能夠獲得系統性抗性，對TMV或其它類似病原的再次入侵產生廣 譜抗性。通過一系列的常規雜交和回交轉育，N基因的抗性從屯、葉煙轉育至香料煙中，然后 轉育至煙草品種中。
[0004] 采用雜交育種轉育N基因的抗性，實際上是轉育包含N基因的野生煙染色體片段 (簡稱為N導入片段）。世界上抗TMV煙草育種利用的幾乎都是N導入片段。代表性品種 是較早商業化種植的包含N導入片段的抗TMV煙草品種Cokerl76和Spei曲t肥0。
[0005] 由于產量較低、上部葉落黃較慢等連鎖累寶，包含N導入片段的煙草品種不能滿 足生產的迫切需要。已有研究證明N基因本身無產量和產值的連鎖累寶，連鎖累寶來源于 N導入片段上的其他基因。N導入片段較短的枯斑資源，推測其連鎖累寶可能較小，育種利 用潛力較大。盡管N基因在20年前被克隆，但N導入片段的長度和伴隨的累寶基因一直不 清楚，限制了的N基因在商業品種中的應用。常規育種技術無法估算N導入片段的長度，產 量、落黃和烘烤等性狀為數量性狀，在育種早期難W選擇。估算N導入片段長度的技術手段 缺乏，導致抗TMV煙草育種缺乏突破性進展。因此如何克服現有技術的不足是目前煙草抗 TMV育種技術領域亟需解決的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種估算煙草N導入片段左端長 度的分子標記、引物及方法，該分子標記、引物及方法可用于篩選N導入片段較短的資源和 育種單株，達到減少N導入片段的連鎖累寶的效果，為選育出高抗TMV，且無明顯產量和質 量劣勢的煙草品種提供技術手段。
[0007] 本發明的目的是提供估算煙草N導入片段左端長度的分子標記。
[0008] 本發明的另一目的是提供一種估算煙草N導入片段左端長度的PCR擴增方法所用 的引物對。
[0009] 本發明的又一目的是提供一種估算煙草N導入片段左端長度的方法。
[0010] 本發明的再一目的是提供上述分子標記、引物對及估算方法在煙草TMV抗病基因 定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。
[0011] 為了實現上述目的，本發明采用了W下技術方案：
[0012] 本發明公開了估算煙草N導入片段左端長度的分子標記，所述的分子標記為Seq IDNo. 1 或SeqIDNo. 2 所示序列。
[001引本發明還公開了估算煙草N導入片段左端長度的PCR擴增方法所用的引物對，所 述的引物對為化4. 06引物對或化3. 50引物對；
[0014] 所述的化4. 06引物對的序列如下：
[0015]化4. 06-F1 :5, -gatcccacgagtggagca-3，（SeqIDNo. 3)，
[0016]化4. 06-Rl:5' -tcctcaccaaacccaacttt-3，(SeqIDNo. 4);
[0017] 所述的化3. 50引物對的序列如下：
[0018]化3. 50-F1 :5' -ttgagaaccgtccaatttcc-3'（SeqIDNo. 5)，
[0019]化3. 50-Rl:5, -cccctgagtcgaacaagtcaa-3，（SeqIDNo.6)。
[0020]N導入片段是指包含TMV抗病基因（腳的野生煙染色體片段。N導入片段較短的 煙株，其連鎖累寶可能較小。
[0021] 本發明還公開了一種估算煙草N導入片段左端長度的方法，W上述的化4. 06引物 對或化3. 50引物對為引物，W待檢測的包含N導入片段的煙草基因組DNA為模板，進行PCR 擴增，擴增產物進行電泳檢測，如擴增出對應大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的N導入 片段在該分子標記位置與抗病對照材料Samsun順無差異；如沒有擴增出對應大小的DNA 片段，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Samsun順短； [002引N導入片段長度估算：根據N導入片段左端分子標記檢測為陰性或陽性，判斷N片 段缺失或者包含該標記對應的基因。利用N導入片段的左末端鄰近的兩個標記檢測估算其 長度。若內側標記為陽性，外側標記檢測為陰性，表明該資源的N導入片段末端位于運兩個 標記之間，N導入片段的長度用其左右末端陽性標記的基因組物理距離表示。某資源N導 入片段特異分子標記檢測陰性越多，則表明該資源的N導入片段越短。
[002引其中，
[0024] 當W所述的化4. 06引物對進行PCR擴增，如果擴增出39化P大小的DNA片段，即 SeqIDNo. 1所示序列的分子標記，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置與抗 病對照材料Samsun順無差異；如沒有擴增出39化P大小的DNA片段，則表明被檢測煙草的 N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料SamsunNN短；
[00巧]當W權利要求2所述的化3. 50引物對進行PCR擴增，如果擴增出654bp大小的DNA片段，即SeqIDNo. 2所示序列的分子標記，則表明被檢測煙草的N導入片段在該分子 標記位置與抗病對照材料Samsun順無差異；如沒有擴增出654bp大小的DNA片段，則表明 被檢測煙草的N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材料Samsun順短。
[0026] 本領域技術人員應該理解擴增產物不僅限于用電泳檢測，還可W采用測序的方法 來確定。
[0027] 進一步，優選的是所述的PCR的反應體系如下：
[0028] DNA模板 50n巧化L 2.5\Jl 1 日XPCRbuffer 2.0 叫， dNTPs2.疫mM 1.2 昨， 引物對中的引物lOumol/11L各1.§mL;， Ex-TaqDNAl犧 5U/uL 0.3 心
[0029] ddHsQ 余量，
[0030] 總體積為20yL;
[0031] 所述的引物對為化4. 06引物對或化3. 50引物對。
[0032] 進一步，優選的是所述的PCR反應程序：94°C預變性5min;然后進入35個循環： 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s;循環結束后72°C延伸lOmin;4°C保存。
[0033] 本發明的分子標記序列（SeqIDNo. 1和SeqIDNo.。是通過W下技術方 案獲得的。利用參考基因組學的方法，W及已測序的含N基因煙草品種TN90基因組 [Sierro,N. ,Battey,J.N. ,Ouadi,S. ,Bakaher,N. ,Bovet,L. ,Willig,A. ,Goepfert,S. ,Pei tsch,M.C.andIvanov,N.V. (2014)Thetobaccogenomesequenceanditscomparison withthoseoftomatoandpotato.Nat.Commun. , 5,doi:10. 1038/ncomms4833]。 利 用煙草抗TMV的N基因序列（Genbank登錄號U15605. 1)，比對番茄基因組化ttp: // solgenomics.net/)。煙草N基因匹配至番茄基因Solycllg011350. 1. 1，該基因位于番 茄染色體化rll:4, 391，578. .4, 397,668處。根據番茄N基因同源體所在11號染色體 4. 39Mb左側1. 0Mb周圍的低拷貝基因，采用BLAST方法調取TN90基因組中的基因序列， 將TN90基因序列與野生祖先N.sylvestris和N.tomensformis基因組進行blastn比 對，選取比對identity值最高的兩個基因。根據TN90的同一位點的兩個拷貝與野生祖 先N.sylvestris和N.tomensformis比對identity值判斷該拷貝是否來自屯、葉煙。一 個拷貝與N.tomensformis中的基因identity大于99 %，另一個拷貝與N.sylvestris和 N.tomensformis中的基因identity小于95%，即該拷貝為來自屯、葉煙的漸滲片段，從而 得知來自屯、葉煙的漸滲片段替代了來自N.sylvestris基因組的片段。若比對的identity 小于95%的序列為來自屯、葉煙的漸滲片段，根據在TN90基因組數據庫中調取的序列，設計 TN90特異引物。在Cokerl76,屯、葉煙，Samsun順，SR1 (不含腳中擴增，屯、葉煙與不含N基 因普通煙草相比的特異條帶為N導入片段的特異標記。若比對的identity均大于99%，設 計保守引物，在Cokerl76,屯、葉煙，S