amsun順，SR1 (不含腳中擴增，將擴增片段測序，比對 測序結果，設計屯、葉煙特異的引物，再次在上述品種中擴增，篩選屯、葉煙特異條帶，開發為N 導入片段的特異標記。將特異條帶的PCR產物回收，送寶生物公司測序。獲得包含本發明 的分子標記序列（SeqIDNo. 1和SeqIDNo. 2)。
[0034] 番茄和煙草同為茄科作物，番茄的基因組大小為800Mb，二倍體煙草祖先種的基因 組大小約為2. 5抓。煙草基因組大小為番茄的3倍左右。番茄N基因同源體在番茄11號染 色體的4. 39Mb處，番茄N基因同源體左側1. 0Mb范圍內，在煙草染色體距離按照番茄距離 的3倍計算，對應煙草N基因所在染色體的范圍為3. 0Mb。因此，本發明公開的分子標記距 離N基因的物理距離可遠達3. 0Mb左右。與N基因的物理距離較遠的分子標記，適宜用于 估算N導入片段的長度。本發明公開的分子標記SeqIDNo. 1和SeqIDNo. 2在番茄染色 體上對應的物理位置分別為化rll-3. 50Mb和化rll-4. 06Mb，在番茄上距離N基因同源體的 物理距離分別為0. 89Mb、0. 33Mb。在煙草染色體距離按照番茄距離的3倍計算，在煙草上距 離N基因的物理距離分別為2. 67Mb、0. 99Mb。
[0035] 在本發明的一個實施方案中，所述分子標記為煙草基因組中SeqIDNo. 1和Seq IDNo. 2所示核巧酸序列的DM片段，即所包含的SeqIDNo. 1和SeqIDNo. 2的5'端 和/或3'端W外的核巧酸序列也是煙草基因組中的序列，優選的，為煙草基因組中SeqID No. 1和SeqIDNo. 2的5'端和/或3'端的上下游序列。本領域技術人員可W理解，只要 擴增或者檢測包含N導入片段的煙草基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增到 含有SeqIDNo. 1 和SeqIDNo. 2 所示的序列。SeqIDNo. 1 和SeqIDNo. 2 的 5' 端和 /或3'端的上下游序列的長度為適當長度，并不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小于 10, 00化P、小于5, 00化P、小于2, 00化P、小于1, 20化P、小于1, 20化P、小于1, 00化P、或者小 于 800bp。
[0036] 對本領域技術人員而言，可W理解，也可WDM化學合成的方法得到本發明的分 子標記。
[0037] 本發明還公開了上述的估算煙草N導入片段左端長度的方法在選育煙草抗TMV品 種中的應用。
[0038] 本發明還公開了上述的估算煙草N導入片段左端長度的分子標記在煙草TMV抗 病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。本發明的分子標記可用于選育煙草抗TMV 品種中，本領域技術人員可W理解，比如通過檢測是否存在本發明的分子標記來篩選估算N 導入片段的長度。含有所述分子標記表明N導入片段在該分子標記位置與抗病對照材料 Samsun順無差異，不含有所述分子標記表明N導入片段在該分子標記位置比抗病對照材 料Samsun順短。
[0039] 所述檢測可W是PCR檢測的方法，具體地，可W使用化4. 06引物對或化3. 50引物 對進行PCR擴增。所述檢測還可W通過測序方法進行。該煙草育種輔助選擇方法具有簡便、 快速、高通量的優點。
[0040] 本發明還公開了上述的估算煙草N導入片段左端長度的PCR擴增方法所用的引物 對在煙草TMV抗病基因定位或選育煙草抗TMV品種中的應用。
[0041] 本發明與現有技術相比，其有益效果為：
[0042] 本發明提供了估算煙草N導入片段左端長度的分子標記，與N基因緊密連鎖但與N 基因的物理距離較遠，與煙草N基因的物理距離在2MbW上。與文獻已報道的N基因抗性 相關分子標記相比，本發明所述分子標記是用于估算N導入片段長度，而不是用于評價N基 因介導抗性的有無。選擇N導入片段較小的材料或育種單株，可望減少與N基因緊密連鎖 的累寶，如減少產量降低幅度。
[0043] 本發明的分子標記、PCR擴增方法所用的引物對及估算方法可W簡便、快速、高通 量地應用于煙草TMV抗病基因定位、選育煙草抗TMV品種及育種材料N導入片段長度鑒定， 有利于減少與N基因連鎖的累寶。
【附圖說明】
[0044]圖1是本發明W化4. 06為引物對的擴增產物電泳檢測結果；
[0045] 圖2為本發明W化3. 50為引物對的擴增產物電泳檢測結果；
[0046]其中，1 為Cokerl76 ;2 為屯、葉煙；3 為Samsun順；4 為Xanthinc;5 為K326;泳 道M為marker,其為lOObpDNALadder。
【具體實施方式】
[0047] 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0048] 本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發 明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件 或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過購買獲得的 常規產品。
[0049] 本發明公開了引物對W及估算N導入片段左端長度的分子標記。利用本發明的引 物對，W煙草基因組DNA為模板進行PCR，可W得到估算N導入片段左端長度的分子標記。需 要指出的是，本領域技術人員可W理解，除了通過上述PCR擴增獲得本發明的分子標記外， 還可W通過化學合成獲得本發明的分子標記。
[0050] 估算煙草N導入片段左端長度的分子標記，所述的分子標記為SeqIDNo.1或Seq IDNo.2所示序列。
[0051] 估算煙草N導入片段左端長度的PCR擴增方法所用的引物對，所述的引物對為 化4. 06引物對或化3. 50引物對；
[005引所述的化4. 06引物對的序列如下：
[0053]化4. 06-F1 :5, -gatcccacgagtggagca-3,，
[0054]化4. 06-R1 :5，-tcctcaccaaacccaacttt-3，；
[005引所述的化3. 50引物對的序列如下：
[0056]化3. 50-F1 :5，-ttgagaaccgtccaatttcc-3,，
[0057]化3. 50-R1 :5, -cccctgagtcgaacaagtcaa-3,。
[0058] 本領域技術人員熟知，在上述SeqIDNo. 3-6所示序列中，可在其5'端或3'端分 別增加1~30個堿基，所增加的堿基類型可根據煙草基因組DNA上與SeqIDNo. 3-6相匹 配區域的堿基類型并依據堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與SeqIDNo. 3-6的擴 增產物基本相同（上游和下游引物之間的DNA序列相同）。因此，上述在SeqIDNo. 3-6的 5'端或3'端分別增加1~30個堿基并能擴增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在 本發明的引物對中。在本發明具體的實施方式中，本發明的引物對優選為SeqIDNo. 3-6 所示序列。
[0059] 包含N導入片段的抗TMV煙草材料：屯、葉煙（N.glutinosa)，Coke;rl76，Samsun順， Xanthinc。未包含N導入片段的感TMV材料SR1和K326。W上煙草材料均為常見的煙草 種質資源，公眾可從煙草種質資源保存單位或云南省煙草農業科學研究院獲得。
[0060] N.toba州m(TN90)、番茄、N.s}dvest;ris、N.tomensformis的參考基因組序列公眾 可從http://solgenomics.net/ 獲得。
[006。 瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒、DM片段純化試劑盒購自QIAGEN公司。DMMarker、 TaqDM聚合酶均購自大連寶生物公司。其他化學試劑均為市售產品。
[0062] 實施例1
[0063] 一、DNA提取
[0064] 用常規CTAB法分別提取煙草基因組DNA，方法為：
[0065] (1)稱取煙草葉片lOOmg左右置于1. 0血離屯、管中，加液氮用研棒研磨至粉末狀；
[0066] 似加入900y1預熱到65°C的2XCTAB緩沖液燈ris-肥1抑為7. 5100mM，EDTA 20mM，化Cl1. 4M，CTAB質量百分濃度為2% )，65°C度水浴20分鐘后取出冷卻；
[0067] (3)加入200yl氯仿-異戊醇混合液（氯仿和異戊醇的體積比為24 :1)搖勻，4°C 離屯、10min(7200;rpm)后轉移上清至1. 0血EP管；
[006引（4)再次加入200y1氯仿-異戊醇混合液（氯仿和異戊醇的體積比為24 :1)搖 勻，4°C離屯、10min(7200;rpm);
[0069] (5)取出上清置于新的EP管中，加入是該上清1/10體積濃度為3MP冊.2醋酸鋼， 同時加入與該上清等體積異丙醇，搖勻后4°C離屯、20min(1200化pm);
[0070] (6)棄上清，用體積百分濃度為75%的乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩 沖液融解，放置-20°C保存備用。
[0071] 二、PCR擴增及電泳檢測
[007引 PCR反應體系如下：
[0073] DNA模極 50 打g/|jL 2.反[iL， 1日xRCRbuffer 2.日扯， dNTPs2.5mM 1.2 [jL, 引物對中的引物10umol/uL各1,5mU Ex-TaqDNA峨 5U/UL 0.3 叫.， ddhkO 余；i;:，
[0074] 總體積為20yL;
[00巧]所述的引物對為化4. 06引物對或化3. 50引物對。
[0076] 所用試劑購自寶生物公司。
[0077]PCR反應程序如下：94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸 30秒，運行35個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產物可W在4°