]SD液體培養基：6. 7g/L無氨基酸酵母氮源和20g/LD-葡萄糖
[0340]SD瓊脂培養基：6. 7g/L無氨基酸酵母氮源，20g/LD-葡萄糖，和20g/L瓊脂 [0341]SX液體培養基：6. 7g/L無氨基酸酵母氮源，和20g/LD-木糖
[0342]SX瓊脂培養基：6. 7g/L無氨基酸酵母氮源，20g/LD-木糖，和20g/L瓊脂
[0343]SX液體培養基50 :6. 7g/L無氨基酸酵母氮源，和50g/LD-木糖
[0344] 第一實施方案
[0345](通過易錯PCR在RsXI基因中引入突變）
[0346]使用GeneMorphll(來自Stratagene)，以pRS436GAP-RsXICl-0 作為模板實施易 錯PCR，其中向所述pRS436GAP-RsXICl-0插入源自黃胸散白蟻腸內原生生物的針對酵母密 碼子優化的木糖異構酶基因RsXI-Cl-opt(GenBank:HV438143)。該反應以如下循環實施30 次循環：95°C2分鐘，95°C1分鐘，60°C1分鐘，和72°C1分鐘30秒，并且隨后在72°C反應 10分鐘。所用引物的序列如下：
[0347]pRSSacII-AAA-ATG-F4 :5'-GAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAACCGCGGAAA ATG-3'（SEQIDN0:41)和
[0348]pRSXhoI-TAA-R3 :5'-GTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCGAGTTA-3 '（SEQIDNO:42)。
[0349] 使用ZeroBluntT0P0PCR克隆試劑盒，將擴增的DNA片段克隆至PCR-BluntII T0P0 (來自Invitrogen)，并且分析插入的DNA片段。作為結果，證實在DNA片段中隨機引 入每1000個堿基平均3個突變（錯誤率0. 3% )。
[0350] 第二實施方案
[0351](酵母基因表達用基本質粒的構建）
[0352] 構建低拷貝型轉基因載體pRS316GAP。使用引物TDH3p-CYClt-IF-F和R，以 pRS436GAP(DDBJ登錄號：AB304862)作為模板實施PCR。采用以下循環，使用PrimeSTARHS DNA聚合酶（TakaraBioInc.)實施PCR:98°C10 秒，55°C15 秒，72°C1 分鐘 30 秒并重復 30個循環。所用引物的序列如下：
[0353]TDH3p-CYClt-IF-F:5'-TCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3'
[0354](SEQIDN0:43)，和
[0355]TDH3p-CYClt-IF-R:5'-GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC-3'（ SEQIDNO:44)。
[0356]使用In-FusionAdvantagePCR克隆試劑盒（TakaraBioInc.)在限制性酶 PvuII消化的pRS316(NBRP登錄號：BYP562)中插入產生的DNA片段。獲得的質粒命名為 PRS316GAP。
[0357] 第三實施方案
[0358](向酵母引入源自變異XI基因文庫的DNA)
[0359] 將通過易錯PCR產生的DNA片段或通過使用pRS436-GAP-RsXICl-0作為模板、使 用pRSSacII-AAA-ATG-F4 和pRsXhoI-TAA-R3 作為引物并使用PrimeSTARHSDNA聚合酶作 為聚合酶的PCR產生的DNA片段（對照）與限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP混 合，并使用Frozen-EZYeastTransformationII(ZymoResearch)，在釀酒酵母W600W株中 引入（參見日本專利申請公開號2011-147445)，所述菌株隨后在5mLSD液體培養基中培 養。
[0360] 第四實施方案
[0361](在使用木糖作為碳源的培養基中富集培養）
[0362] 在2日培養后，將第三實施方案中的SD培養液添加至5mLSX液體培養基，并在 30°C和 70 轉 / 分鐘在BioPhotorecorderTVS062CA(Advantech)中培養。將細胞在距開 始培養的第7日從培養液回收，并且添加至5mL新鮮SX液體培養基至初始培養液濃度的 0D(600nm)為0. 1。使用BioPhotorecorder，將溶液在30 °C和70轉/分鐘培養7日，并且 從培養液回收細胞。將細胞鋪展在SX瓊脂培養基上并在30°C培養。選擇生長快于酵母的 引入RsXI-Cl-optDNA片段的菌落，在SD瓊脂培養基上劃線，并純化培養的菌落，作為選定 的菌株。
[0363] 第五實施方案
[0364](自選定菌株提取質粒和測序分析）
[0365]使用酵母質粒微量制備試劑盒Zymoprep(ZymoResearch)，從根據第四實施 方案的生長試驗中的比生長速率而言居前10位的菌株和已經引入RsXI-Cl-opt的 菌株提取質粒。作為分析提取的質粒中RsXI-Cl-opt基因結構域的結果，識別出5 個類型的突變體序列。突變體XI基因分別命名為RsXIC10-T76I、RsXIC10-E125G、 RsXIC10-I286F、RsXIC10-N337T和RsXIC10-K384E;并且用于相應基因的酵母表達載體命 名為pRS316GAP-RsXlC10-T76I、pRS316GAP-RsXIC10-E125G、pRS316GAP-RsXIC10-I286F、 pRS316GAP-RsXIC10-N33n、和pRS316GAP-RsXIC10-K384E。另外，野生型RsXI-Cl-opt的酵 母表達載體命名為pRS316GAP-RsXIC10。
[0366] 第六實施方案
[0367](向酵母引入突變基因）
[0368]使用Frozen-EZ酵母轉化II(ZymoResearch)，將第五實施方案中制備的質粒按 照與第三實施方案相同的方式引入釀酒酵母W600W菌株的酵母中（參見日文專利申請公開 號2011-147445)，并且將酵母鋪展在SD瓊脂培養基上并在30°C培養。將長出的菌落在新 鮮的SD瓊脂培養基上劃線并培養以純化。純化后獲得的選定菌株以及所用的質粒命名如 下。
[0369]WR701Is :pRS316GAP-RsXlC10-T76I
[0370]WR702Gs :pRS316GAP-RsXIC10-E125G
[0371]WR703Fs :pRS316GAP-RsXIC10-I286F
[0372]WR704Ts :pRS316GAP-RsXIC10-N337T
[0373]WR705Es :pRS316GAP-RsXIC10-K384E，和
[0374]WR700s：pRS316GAP-RsXIC10
[0375] 第七實施方案
[0376](利用木糖作為碳源的基因修飾酵母的生長試驗）
[0377]在含有木糖作為碳源的培養基中實施生長試驗以評價第六實施方案中獲得的酵 母的木糖利用能力。5個類型在第六實施方案中制備的菌株在SD液體培養基中培養24小 時，并且將細胞回收并且用滅菌水洗滌。此后，向L形試管內準備的SX液體培養基中添加 細胞并且啟動生長試驗。在使用BioPhotorecorderTVS062CA時30°C，70轉/分鐘的培養 條件下的生長試驗期間，按20分鐘間隔測量培養液的0D(660nm)。圖5中顯示相應菌株的 比生長速率的比較。
[0378] 如圖5中所示，證實已經引入RsXIC10-I286F的WR703FS菌株、已經引入 RsXIC10-N33H的WR704TS菌株和已經引入RsXIC10-K384E的WR705ES菌株比生長速率高 于已經引入野生型RsXI-Cl-opt的WR700s菌株。其中，WR704TS菌株的比生長速率1. 6倍 于WR700s菌株。
[0379] 第八實施方案
[0380](利用木糖作為碳源的基因修飾酵母的發酵試驗）
[0381] 將WR700s菌株和WR704TS菌株接種在5mLSD液體培養基中并培養24小時。接 下來，將lmL培養液添加至50mLSD液體培養基并培養24小時。將細胞回收并用滅菌水洗 滌2次。對于發酵試驗，使用以丁基橡膠封閉牢固密封的具有螺蓋的耐壓試管。通過添加 酵母懸液至發酵培養基的最終〇D(600nm)為10,制備5mLSX液體培養基50并將它在30°C 和180轉/分鐘發酵。按自行決定的時序，將等分試樣的發酵液體采樣并通過液相色譜就 木糖和乙醇進行分析。作為液相色譜柱，將HPX-87H柱（Bio-RAD)在60°C使用，并且作為檢 測器，使用差示折射率檢測器RID_10A(ShimadzuCorporation)。對于流動相，使用0.05% 硫酸溶液并且以流速〇. 8mL/min供應。圖6顯示相應菌株的發酵培養基中木糖濃度和乙醇 濃度的時間依賴性變化。在本上下文中，發酵試驗重復4次，并顯示為平均值。
[0382] 如圖6中所示，WR704TS菌株的木糖消耗速率和乙醇產生速率比WR700s菌株高 大約2. 5倍，并且發酵72小時所致木糖消耗量對于WR700s菌株是大約12g/L，但是對于 WR704TS菌株是大約30g/L。從上文已經顯而易見，可以通過將RsXI的位置337處的天冬 酰胺置換為蘇氨酸，改善酵母的木糖利用能力。
[0383] 第九實施方案
[0384](氨基酸點突變文庫的構建及引入酵母）
[0385] 構建了靶向RsXIClOm的第337位氨基酸（天冬酰胺）的氨基酸點突變文庫， 其中對所述RsXIClOm證實了酵母中木糖利用能力的改善作用。使用第五實施方案中描 述的pRS316GAP_RsXIC10作為模板、下表1中列出的引物和QuickChangeLightning MultiSite-DirectedMutagenesis試劑盒（AgilentTechnologies,Inc.)根據該試劑盒所 附的方案，實施反應。使用獲得的反應液，轉化EC0S感受態大腸桿菌DH5a(NipponGene Co.，Ltd.)并從長出的菌落提取質粒。通過測序，鑒定到一個突變基因座并且獲得向酵母引 入每種突變體XI的質粒，所述的每種突變體XI具有18種突變中的任一種，除了天冬酰胺 和蘇氨酸之外（丙氨酸：A，精氨酸：R，天冬氨酸：D，半胱氨酸：C，谷氨酰胺：G，谷氨酸：E，甘 氨酸：G，組氨酸：H，異亮氨酸：1，亮氨酸：L，賴氨酸：K，甲硫氨酸：M，苯丙氨酸：F，脯氨酸： P，絲氨酸：S，色氨酸：W，酪氨酸：Y，和纈氨酸：V)(表1)。隨后使用Frozen-EZ酵母轉化II， 將獲得的質粒引入W600W菌株中，隨后W600W菌株鋪展在SD瓊脂培養基上。將長出的菌落 劃線在新鮮的SD瓊脂培養基上并培養以純化菌落。表1中顯示了獲得的基因修飾酵母、用 于向酵母中引入突變體n的質粒和引入的突變體XI基因。
[0386]表1
[0387]
[0388] 第十實施方案
[0389](利用木糖作為碳源的基因修飾酵母的發酵試驗）
[0390] 將表1中的18種重組酵母、WR700s菌株和WR704TS菌株接種至體積為每孔2mL的 96孔StorageBlock(CorningIncorporated)中所制備的lmLSD液體培養基，并且在恒定 溫度培養搖床M-BR-022UP(TaitecCorporation)中在30°C和1500轉/分鐘培養24小時。 接下來，將200微升培養液添加至96孔StorageBlock中所制備的lmLSD液體培養基中 并在相似條件下培養24小時。將細胞回收，用無菌水洗滌兩次，并懸浮在無菌水中以制備 酵母懸液。發酵試驗在以下條件下進行。在96孔StorageBlock中如此準備lmLSX液體 培養基，從而在其中添加酵母懸液至最終〇D(600nm)為1。為了建立厭氧條件，將每個孔用 TiterStickHC(KajixxCo.，Ltd.)全密封，并且發酵在M-BR-022UP中在 30°C和 1500 轉 / 分鐘條件下實施。按自行決定的時序，將等分試樣的發酵液體采樣并如第八實施方案中那 樣，通過液相色譜就木糖和乙醇進行分析。圖7顯示從發酵開始至此后72小時，已經引入 XI的酵母的木糖消耗量。發酵試驗重復2次或更多次，并顯示平均值。
[0391] 如圖7中所示，發酵72小時后已經引入野生型RsXI基因（RsXI-Cl-opt)的WR700s 菌株的木糖消耗量是2. 6g/L，并且第七實施方案中所示的WR704TS菌株的木糖消耗量是 7. 2g/L。證實從點突變文庫獲得的18種菌株當中，3個菌株WR704Cs、WR704Vs，和WR704AS 中木糖消耗量改善，超過WR700s(分別地是8.9g/L、5. 3g/L和4. 0g/L)。其中，WR704CS菌 株的木糖消耗量超過WR704TS菌株，并且證實改善木糖消耗量至高達WR700s3. 5倍的水 平。從上文顯而易見，可以通過將Rs)(l的位置337處的天冬酰胺置換為蘇氨酸、半胱氨酸、 纈氨酸和丙氨酸中的任一者（編碼該蛋白質的DNA分別由SEQIDN0:71至74表示），改善 酵母的木糖利用能力1. 5倍或更多。
[0392] 第^^一實施方案
[0393](向其他XI引入氨基酸點突變）
[0394] 研究了通過相對于RsXI第337位氨基酸的突變所獲得的木糖利用能力改善作 用是否在源自其他生物學物種的XI中可重復。使用針對酵母密碼子優化的源自梨囊鞭 菌屬物種E2的木糖異構酶基因和源自植發酵梭菌的木糖異構酶基因（日本專利申請公 開號2011-147445)作為模板，以及下表2中列出的引物，合成了引入突變的DNA片段 ?1父10,3381'和0口乂10,3371'(5￡〇10勵:75和5￡〇10從):76)，其中所述突變將對應于1^父1 第337位氨基酸殘基的天冬酰胺置換為蘇氨酸。另外，作為對照，還同時地合成未引入突變 的DNA片段PiXIO和CpXIO。使用In-FusionHDPCR克隆試劑盒（TakaraBioInc.)，將 獲得的DNA片段插入限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP中，以獲得基因轉導質粒。 隨后使用Frozen-EZ酵母轉化II，將獲得的質粒引入W600W菌株中，隨后W600W菌株鋪展在 SD瓊脂培養基上。將長出的菌落劃線在新鮮的SD瓊脂培養基上并培養以純化菌落。表2 中顯示了獲得的基因修飾酵母、用于向酵母中引入突變體n的質粒和引入的突變體XI基 因。
[0395]表2
[0396]
[0397] 第十二實施方案
[0398](利用木糖作為碳源的基因修飾酵母的發酵試驗）
[0399] 將表2中列出的4種重組酵母接種在5mLSD液體培養基中，