選地90 %或更大、然而甚至更優選地95 %或更大并且最優選地98 %或更大的同一 性以及在對應于SEQIDNO: 1位置337的位置處將天冬酰胺置換為除天冬酰胺之外的氨基 酸（優選例子是半胱氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和丙氨酸；將天冬酰胺置換為任何氨基酸的突變 是優選的；并且在一些情況下優選半胱氨酸和蘇氨酸）。
[0304] 本發明的蛋白質是通過多種方法可獲得的。例如，本發明蛋白質可以通過以下方 式獲得，使用選自SEQIDNO: 1和SEQIDN0:14至23的氨基酸序列或編碼該氨基酸序列 的核苷酸序列作為查詢序列，借助公眾已知的同源性檢索、基序分析等提取具有同一性不 低于某個水平的第1基序至第5基序的蛋白質；并且向提取的蛋白質的第5基序中的天冬 酰胺位置引入突變。由本領域技術人員根據公眾已知的技術向氨基酸序列位點特異性引入 突變是可能的。本領域技術人員熟知的制備編碼氨基酸序列經修飾的蛋白質的DNA的方法 例子包括位點定向誘變法（KramerW和FritzH_J:MethodsEnzymol154:350,1987)。
[0305] 備選地，可以使用例如，將特定天冬酰胺位置置換為SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 14 至23中另一種氨基酸的SEQIDN0:30至40或編碼與查詢序列相同的氨基酸序列的核苷 酸序列，提取在特定天冬酰胺處含有除天冬酰胺之外氨基酸的蛋白質。還在自然界中，通過 核苷酸序列的突變，蛋白質的編碼氨基酸序列的突變可能發生。
[0306] 另外，可以使用編碼由SEQIDN0:1、14至23或30至40表示的氨基酸序列的DNA 或其互補鏈作為探針，通過雜交技術分離DNA，并且可以獲得由該DNA編碼的本發明蛋白質 的野生型，隨后將其修飾；或可以直接獲得本發明的蛋白質。另外，使用與該DNA或互補鏈 特異性雜交的寡核苷酸作為引物，可以通過PCR反應獲得本發明蛋白質的野生型，隨后進 行修飾；或可以直接獲得本發明的蛋白質。可以由本領域技術人員常規地如上獲得本發明 的蛋白質。
[0307] 就雜交技術而言，雜交反應應當優選地在嚴格條件下實施。下文將描述嚴格條件。
[0308] 通過以下方式制備本發明的蛋白質：以含有編碼本發明蛋白質的DNA構建體轉化 適宜的宿主如真核細胞，通過本領域技術人員熟知的常規方法培養轉化的宿主細胞，并從 培養的細胞或培養基收獲本發明的蛋白質。該技術是本領域技術人員熟知的。
[0309] (編碼本發明蛋白質的DNA)
[0310] 本發明的DNA是具有編碼本發明蛋白質的核苷酸序列的DNA。本發明的DNA可以 通過合成方式制備編碼本發明蛋白質的DNA或如上文所述，通過位點定向誘變法、雜交技 術、PCR等獲得。
[0311] 雜交中的嚴格條件指例如其中形成所謂特異性雜合體而不形成非特異性雜合體 的條件。例如，包括這樣的條件，從而與SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll或13任一項所代表的核 苷酸序列具有高同一,性如至少70%同一、優選地至少80%同一 ,性、更優選地至少85%、或 仍然更優選地至少90%、或最優選地至少95%同一性的DNA的互補鏈與該DNA雜交，而具 有較低同一性的DNA的互補鏈不與該DNA雜交。一般地，Na鹽濃度是15至750mM、優選地 50至750mM，更優選地300至750mM，溫度是25至70°C，優選地50至70°C，更優選地55至 65 °C，并且甲酰胺濃度是0 %至50 %，優選地20 %至50 %，更優選地35 %至45 %。另外，嚴 格條件包括雜交后的濾膜洗滌條件，一般地，Na鹽濃度是15至600mM，優選地50至600mM， 更優選地300至600mM，并且溫度是50至70 °C，優選地是55至70 °C，更優選地是60至65 °C。
[0312] 在編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列中，可以將編碼預定氨基酸序列的核苷酸序 列中的至少一個堿基按照遺傳編碼簡并性置換為另一個種類的堿基，而不改變蛋白質的氨 基酸序列。因此，本發明的DNA包括這樣的DNA，其編碼按照遺傳編碼簡并性通過置換修飾 的核苷酸序列。本發明DNA可以用為真核細胞（如酵母）中表達而優化的核苷酸序列構成。
[0313] (用于轉化的載體）
[0314] 本文中公開的用于轉化的載體包含適宜啟動子下游的本發明DNA，其與啟動子可 操作地連接。啟動子的例子包括如下文描述在真核細胞等中有功能的各種啟動子和誘導型 啟動子如GAL啟動子。用于轉化的重組載體還可以配有終止子、增強子、復制起點（ori)、標 記物等，并且可以根據需要適當地選擇這類元件。另外，在重組載體意在將所需DNA片段植 入染色體中的情況下，如對于基因置換，重組載體具有與染色體上預定域相對應的同源域。 另外，本發明的載體可以利用適當選擇的市售酵母表達載體等構建。
[0315] 構建重組載體所要求的這類一般操作由本領域技術人員常規實施， 并且本領域技術人員可以通過適當地參考實驗技術手冊，例如T.Maniatis，J. Sambrook等人，''MolecularCloning,ALaboratoryManual"，ColdSpringHarbor Laboratory, 1982, 1989, 2001 實施這些操作。
[0316] (真核細胞）
[0317] 本文中公開的真核細胞是含有本發明DNA的真核細胞。本發明的真核細胞一般是 通過本發明載體轉化的經轉化真核細胞。DNA可以在宿主細胞中滯留于染色體外部，但是優 選地滯留在染色體上。另外，為了顯示高木糖利用能力，例如優選地滯留其多個副本。
[0318] 對作為下文公開的轉化體的宿主的真核細胞不存在具體限制。從物質生產等 的觀點看，它可以是曲霉（Aspergillus)或其他霉菌或酵母。曲霉屬物種的例子包括棘 抱曲霉（Aspergillusaculeatus)、米曲霉（Aspergillusorizae)等。酵母的例子包括 各種已知的酵母、包括釀酒酵母和其他酵母屬（Saccharomyces)酵母、粟酒裂殖酵母屬 (Schizosaccharomycespombe)和其他裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)酵母、休哈塔 假絲酵母（Candidashehatae)和其他假絲酵母屬（Candida)酵母、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)和其他畢赤酵母屬（Pichia)酵母、漢遜酵母屬（Hansenula)酵母、克勒克氏酵母 屬（Klocckera)酵母、許旺酵母屬（Schwanniomyces)酵母和耶羅維亞酵母屬（Yarrowia) 酵母、絲孢酵母屬（Trichosporon)酵母、酒香酵母屬（Brettanomyces)酵母、管囊酵母屬 (Pachysolen)酵母、Yamadazyma酵母、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus)、乳 酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis)和其他克魯維酵母屬（Kluyveromyces)酵母、東方 伊薩酵母（Issatchenkiaorientalis)和其他伊薩酵母屬（Issatchenkia)酵母等。這些 酵母當中，從工業利用的觀點看，優選酵母屬酵母。這些酵母屬酵母當中，優選釀酒酵母。
[0319]DNA由宿主以它可以表達的方式攜帶。S卩，它可以在合適啟動子控制下連接，并且 也可以提供終止子、增強子、復制起點（ori)、標記物等。啟動子可以是誘導型或組成型的。 酵母中的組成型啟動子的例子包括3-磷酸甘油酸激酶（PGK)啟動子、3-磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH)啟動子、醇脫氫酶1(ADH1)啟動子、組氨酸營養功能基因（HIS3)啟動子、細胞色素 bcl復合體（CYC1)啟動子和高滲響應性7基因（H0R7)啟動子和這些啟動子的修飾物。
[0320] 真核細胞也可以是在胞外或在細胞表面上分泌型表達纖維素酶或半纖維素酶的 一種真核細胞。例子包括葡聚糖內切酶、纖維二糖水解酶、0 _葡糖苷酶和各種其他纖維素 酶以及半纖維素酶和其他生物質降解酶。這類蛋白質的表達允許有效利用除衍生自木質纖 維素的木質素之外的糖。本說明書中公開的轉化體也可以是一種已經根據需要給予基因工 程修飾如引入外源基因或破壞內源基因的轉化體。
[0321] 真核細胞可以是一種能夠通過發酵產生所需的有用化學物質的真核細胞，如下文 所解釋。可以向能夠產生有用化學物質的真核細胞提供參與產生這種有用化學物質的內源 基因和/或外源基因。也可以破壞所需的內源基因。酵母通常通過厭氧發酵產生乙醇，但 是已經通過基因工程修飾等轉化以使其能夠產生另一種有用化學物質的宿主也是可能的。 有用化學物質的例子不僅包括乙醇，還包括乳酸、乙酸、1，3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙 烯和甘油。優選地，轉化體能夠產生這些物質中的一種或兩種或更多種作為有用物質。本 說明書中公開的轉化體的宿主可以包含對產生有機酸如乳酸的酵母等的基因修飾等（日 本專利申請公開號2003-259878、日本專利申請公開號2006-006271、日文專利申請公開號 2006-20602、日本專利申請公開號2006-75133、日本專利申請公開號2006-2966377和日本 專利申請公開號2007-89466)。
[0322] 向宿主細胞引入載體的方法包括磷酸鈣法、轉化法、轉染法、接合法、原生質體融 合法、電穿孔法、脂轉染法、乙酸鋰法和本領域已知的任何其他方法。這些技術在出版的書 籍中描述，包括上文提到的文本。可以通過在引入載體的酵母當中按標記基因篩選或表達 基因的活性，獲得本說明書的轉化體。
[0323] (產生有用化學物質的方法）
[0324] 提供了本說明書中公開的有用化學物質生產方法，以及在木糖存在下培養真核細 胞的步驟。因為真核細胞具有木糖利用能力，它可以有效地使用所含的任何木糖作為碳源， 并將它以本說明書中公開的生產方法轉化成有用物質。因此，甚至當培養基含有木質纖維 素的糖，包括木糖時，可以有效地利用這種生物質碳源并且將其轉化成有用物質。除木糖之 外，木質纖維素糖可以包括葡萄糖，以及半纖維素分解產物。
[0325] 木糖包括阿糖基木聚糖、葡糖醛酸木聚糖和其他木聚糖。在自然界中，這些聚合物 形成半纖維素的一個組分，并且在木質纖維素和生物質的其他形式等中存在。木糖可以通 過用木聚糖內切酶、木糖苷酶等消化木聚糖獲得。
[0326] 有用化學物質也可以是這樣的化合物，其不是本來的代謝物，而是通過將葡萄糖 代謝系統的一種或兩種或更多種酶以遺傳方式工程化置換、添加等使酵母能夠產生的一個 化學物質。有用化學物質的例子包含乙醇以及低級醇、乳酸、乙酸和其他有機酸。此外，還 有通過添加類異戊二烯合成途徑獲得的1，3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、甘油和乙烯、法 呢醇、香葉基香葉醇、鯊烯和其他類萜和精細化學品（輔酶Q10、維生素和其他原料等）。另 外，包括因糖酵解系統中的修飾所獲得的丙三醇、塑料、合成原料等和生物煉制技術中使用 的其他材料。由于酵母具有醇發酵高性能，所以轉化體可以在含碳源（包括木糖）的培養 基中有效產生乙醇。具有醇發酵高性能的酵母通過糖酵解系統的修飾而具有高的有機酸和 其他有用物質性能。
[0327] 在培養步驟中，使用含有木糖作為碳源的培養基。另外，培養基可以含有葡萄糖。 優選地，碳源衍生自生物質碳源，包括木質纖維素。此外，當酵母表達纖維素酶并具有纖維 素代謝能力時，纖維素或其部分降解的產物可以包含于培養基中。
[0328] 培養步驟可以根據從適用于真核宿主細胞的一般培養條件適當選擇的培養條件 完成。一般地，可以使用靜置培養、振蕩培養或通氣攪拌培養等作為發酵培養。通氣條件可 以適當地設定為厭氧條件、微有氧條件或有氧條件。培養溫度不作具體限制，并且可以處于 25°C至55°C范圍內。培養時間可以根據需要設定，并且可以是數小時至約150小時。可以 用無機酸或有機酸或堿溶液等調節pH。可以將抗生素如氨芐青霉素或四環素根據需要在培 養期間添加至培養基。
[0329] 借助培養步驟，根據所用微生物的有用物質產生能力，產生有用化學物質。例如， 用具有產乙醇能力的真核細胞獲得乙醇。因生物基因修飾等具有產生乳酸和其他有機酸的 能力的真核細胞可以用來產生乳酸等。在完成有用物質產生步驟后，可以是從培養液收集 含有有用物質的級分的步驟，和純化或濃縮有用物質的另一個步驟。收集、純化過程和其他 過程可以根據有用物質的類型等適當地選擇。
[0330] 有用物質產生步驟可以后續從培養液收集含有有用物質的級分的步驟，和提煉或 濃縮這個級分的又一個步驟。收集步驟和提煉步驟或其他步驟可以根據有用物質的類型等 適當選擇。
[0331] (篩選具有木糖異構酶活性的蛋白質的方法）
[0332] 本說明書提供一種篩選具有木糖異構酶活性的蛋白質的方法。本發明的篩查方法 可以包括步驟：與SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列比對時評估修飾的蛋白質的木糖異構酶 活性，其中修飾的蛋白質從所述蛋白質的N末端按所述順序含有以下第1基序至第6基序， 并且以另一種氨基酸替換具有木糖異構酶活性的蛋白質的第6基序的氨基酸序列中的天 冬酰胺（N)。根據該方法，可以獲得在木糖異構酶活性方面改善的修飾蛋白質。特別地，可 以獲得可用于酵母中表達的修飾的蛋白質。待置換的前述另一種氨基酸選自多種天然存在 的氨基酸，并且這些當中，可以例舉半胱氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和纈氨酸，尤其是半胱氨酸和 蘇氨酸。就修飾的蛋白質中第1基序至第6基序而言，可以使用上文描述的優選實施方案。
[0333] 作為獲得這種修飾的蛋白質的蛋白質源，可以將RsXI的氨基酸序列作為查詢序 列由蛋白質BLAST(數據庫使用非冗余蛋白質序列，并且Algorism參數處于默認設置）檢 索，并且可以使用其他相似氨基酸序列的前500種；并且它們當中，優選地可以例舉前400 種、前300種、前200種或前100種的蛋白質。可以使用如上文所述的比對分析鑒定第6基 序中天冬酰胺的位置。值得注意地，可以通過如上文討論的獲得蛋白質的方法獲得待篩選 的修飾的蛋白質。
[0334] (用于產生具有木糖異構酶活性的蛋白質的方法）
[0335] 根據本說明書，還提供了一種用于產生具有木糖異構酶活性的蛋白質的方法。本 發明的生產方法可以包括步驟：產生具有木糖異構酶活性的蛋白質，所述蛋白質是修飾的 蛋白質，所述修飾的蛋白質與SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列比對時從該蛋白質的N末端 按所述順序含有以下第1基序至第6基序，并且以另一種氨基酸替換具有木糖異構酶活性 的蛋白質的第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺（N)。根據該方法，可以容易地產生具有木 糖異構酶活性的修飾的蛋白質。對于其他氨基酸、蛋白質源和基序的多個方面，可以類似于 上文所述的篩選方法來應用上文所述的多個方面。
[0336] 實施方案
[0337] 下文使用實施例詳細解釋本發明教導，但是本發明不受實施例限制。下文描述 的遺傳重組操作根據MolecularCloning:ALaboratoryManual(T.Maniatis等人，Cold SpringHarborLaboratory)進行。
[0338] 以下實施例中所用的培養基的組成如下：
[0339