具有木糖異構酶活性的蛋白質及其用圖
【技術領域】
[0001] (關申請的交互引用）
[0002] 本申請涉及2013年3月28日提交的日本專利申請號2013-070584和2014年2 月12日提交的日本專利申請號2014-024878并且要求所述日本申請的優先權，其全部內容 通過引用的方式并入本文。
[0003] 本申請涉及一種具有新木糖異構酶活性的蛋白質，并且涉及以木糖作為碳源使用 這種蛋白質產生有用物質的技術。
【背景技術】
[0004] 作為用于纖維素乙醇生產工藝的發酵微生物，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)不能夠利用植物生物量中大量包含的木糖。因此，向釀酒酵母賦予木糖利用能 力的研究正在進行中。為此目的，研究向酵母引入2個類型的途徑。一個是使用木糖還原 酶（XR)和木糖醇脫氫酶〇(DH)的途徑（XR-XDH途徑）。然而，該途徑中存在中間代謝物積 累和乙醇產率下降的缺點。同時，在途徑（XI途徑）使用木糖異構酶（XI)的情況下，不存 在這種缺點，但是出現另一個缺點，即與XR-XDH途徑相比，木糖消耗速率緩慢。因此，關于 高效XI的各種研究正在進行中。
[0005] 已經實施對源自梨囊鞭菌屬物種（Piromycessp. )E2的XI的改善，其中將所述XI 報告為能夠在酵母中發揮作用的第一種XI(專利文獻1，非專利文獻1)。另外，也已經實施 對源自黃色瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens)的XI的改善（專利文獻2)。另外，也 已經實施對源自乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)的XI的改善（專利文獻3)。另外，已 經報道源自黃胸散白蟻（Reticulitermessperatus)腸內原生生物的XI，其中與之前已知 的XI相比，所述XI具有更高的酵母木糖消耗能力（專利文獻4)。
[0006] 引文目錄
[0007] 專利文獻
[0008] [專利文獻1]日本專利申請公開號2008-79564
[0009] [專利文獻2]TO2011/15〇313
[0010] [專利文獻3]TO2〇10/〇7〇549
[0011] [專利文獻4]日本專利申請公開號2011-147445
[0012] 非專利文獻
[0013] [非專利文獻 1]LeeS，JellisonT，AlperHS.ApplEnvironMicrobiol, 2012 ; 78(16):5708-16
[0014] 發明概述
[0015] 但是，專利文獻1和非專利文獻1中XI的木糖消耗速率仍太低。另外，就專利文 獻1中的XI而言，未公開在酵母中的活性。同時，就專利文獻2中的XI而言，盡管已經認 可改善了轉基因酵母在木糖培養基中的生長速率，但是發酵性能不清楚。另外，就專利文獻 3中的XI而言，在木糖培養基中的生長特性和發酵性能不清楚。另外，就專利文獻4中描述 的XI而言，雖然XI在酵母中的能力已經改善，但是要尋求對其進一步改善。
[0016] 在這類情形下，仍然需要有利于改善酵母中木糖消耗能力并改善發酵能力的XI。
[0017] 根據本說明書，提供了具有可用于改善酵母的木糖發酵能力的XI活性的蛋白質 及其用途。
[0018] 技術問題的解決方案
[0019] 本發明人集中在源自黃胸散白蟻腸內原生生物的XI(下文稱作"RsXI"）并且發 現可以通過引入置換另一氨基酸的點突變修飾XI，改善酵母的木糖發酵能力。另外，發現 引入XI中的氨基酸置換突變還在具有相似氨基酸序列的另一種XI中有效。基于該研究結 果，下文公開了以下手段。
[0020] [1]具有木糖異構酶活性并且具有氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列與SEQ IDNO: 1所示的氨基酸序列比對時從所述蛋白質的N末端起按以下順序包含以下第1至第 6基序，并且以另一氨基酸替換第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺（N):
[0021] 第 1 基序：FXXXXKXXXXXXXXHDXD(SEQIDN0:2)
[0022] 其中X表示天然存在的氨基酸，
[0023] 第 2 基序：XXXXXXXWGGREGYXXLXNT(SEQIDN0:3)
[0024] 其中X表示天然存在的氨基酸，
[0025] 第 3 基序：XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDN0:4)
[0026] 其中X表示天然存在的氨基酸，
[0027]第4基序：LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH(SEQIDN0:5)
[0028] 其中X表示天然存在的氨基酸，
[0029] 第 5 基序：XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP(SEQIDN0:6)
[0030] 其中X表示天然存在的氨基酸，和
[0031] 第 6 基序：GGXNFDXKXRR(SEQIDN0:7)
[0032] [2]根據[1]的蛋白質，其中：
[0033] 第 1 基序由FXXXXKXGXXXXXFHDXD(SEQIDN0:8)表示，
[0034] 第 2 基序由XXXXXVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDN0:9)表示，
[0035] 第 3 基序由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO: 10)表示，
[0036] 第 4 基序由LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH(SEQIDN0:11)表示，
[0037]第 5 基序由XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO: 12)表示，并且
[0038] 第 6 基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDN0:13)表示。
[0039] [3]根據項[1]或[2]的蛋白質，其中：
[0040] 第 1 基序由FEXXXKXGXXXXCFHDXD(SEQIDN0:102)表示，
[0041] (其中位置3是F或I或L;位置4是A或M;位置5是E或Q或S或T;位置7是 L或M;位置9是I或V;位置10是E或K或P;位置11是F或Y;位置12是F或Y;并且位 置17是A或I或V)，
[0042] 第 2 基序由GXXXYVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDN0:103)表示，
[0043] (其中，位置2是A或G;位置3是V或K或E;位置4是G或N;位置15是E或M; 并且位置16是S或T)，
[0044] 第 3 基序由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDN0:10)表示，
[0045] (其中，位置1是G或N;位置2是F或H;位置3是K或D或L;位置4是G或P; 位置5是D或T或I;位置7是L或Y;位置13是K或M;位置16是M或T;位置17是K或 1';并且位置22是？或￥)，
[0046]第 4 基序由LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH(SEQIDN0:104)表示，
[0047] (其中，位置2是D或E;位置4是D或Y;位置7是L或M或V;位置9是I或L; 位置11是A或T或V;位置15是T或W;并且位置22是Q或E)，
[0048]第5基序由XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDN0:105)表示，
[0049] (其中，位置1是F或L;位置4是I或V;位置8是Q或R或T;位置10是D或N; 位置11是P或Y;位置12是L或N或Q;位置13是L或N，并且位置19是E或?，以及
[0050]第 6 基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDN0:13)表示，
[0051] (其中，位置3是I或L或T;位置7是A或S;并且位置9是T或V)。
[0052] [4]根據[1]至[3]中任一項的蛋白質，其包含選自半胱氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和丙 氨酸的替換第6基序中天冬酰胺（N)的氨基酸。
[0053] [5]根據[1]至[4]中任一項的蛋白質，其包含替換天冬酰胺的蘇氨酸或半胱氨 酸。
[0054] [6]根據[1]至[5]中任一項的蛋白質，其中
[0055] 第1基序由與SEQIDN0:24表示的氨基酸序列具有65 %或更大同一性的氨基酸 序列組成，
[0056] 第2基序由與SEQIDN0:25表示的氨基酸序列具有75 %或更大同一性的氨基酸 序列組成，
[0057] 第3基序由與SEQIDN0:26表示的氨基酸序列具有65 %或更大同一性的氨基酸 序列組成，
[0058] 第4基序由與SEQIDN0:27表示的氨基酸序列具有70 %或更大同一性的氨基酸 序列組成，
[0059] 第5基序由與SEQIDN0:28表示的氨基酸序列具有70%或更大同一性的氨基酸 序列組成，并且
[0060] 第6基序由與SEQIDN0:29表示的氨基酸序列具有70 %或更大同一性的氨基酸 序列組成。
[0061] [7]DNA，其編碼根據[1]至[6]中任一項的蛋白質。
[0062][8]用于真核細胞的轉化載體，其含有根據[7]的DNA。
[0063] [9]真核細胞，其含有根據[7]的DNA。
[0064][10]根據[9]的真核細胞，其是酵母。
[0065] [11]根據[10]的真核細胞，其中酵母屬于選自以下的任一個屬：酵母屬 (Saccharomyces)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、假絲酵母屬（Candida)、畢赤酵母屬 (Pichia)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬（Hancenula)、克勒克氏酵母 屬（Klocckera)、許旺酵母屬（Schwanniomyces)、耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)和伊薩酵母 屬（Issatchenkia)〇
[0066] [12]根據[9]至[11]任一項的真核細胞，其產生分泌的纖維素酶。
[0067] [13]根據[9]至[12]中任一項所述的真核細胞，其具有產生選自以下任一種物 質的外源或內源基因：乙醇、乳酸、乙酸、1，3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢 醇、香葉基香葉醇和鯊烯。
[0068] [14]用于產生具有賦予的或改善的木糖利用能力的真核細胞的方法，其包括將根 據[7]的DNA導入真核細胞用于轉化的步驟。
[0069] [15]用于生產有用物質的方法，其包括在木糖存在下培養根據[9]至[13]中任一 項所述的真核細胞的步驟
[0070] [16]根據[15]的生產方法，其中有用物質是選自以下的任一種：乙醇、乳酸、乙 酸、1，3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香葉基香葉醇和鯊烯。
[0071] 附圖簡述
[0072][圖1]圖1是顯示在酵母中有活性的XI的氨基酸序列與RsXI的氨基酸序列的同 一,性的圖。
[0073][圖2]圖2是顯示RsXI和其他在酵母中具有活性的XI的序列標志（logo)分析 結果和基序分析結果的圖。
[0074] [圖3]圖3是顯示RsXI和其他在酵母中具有活性的XI的氨基酸序列比對的圖。
[0075][圖4]圖4是對在酵母中具有活性的XI的每個基序顯示同一性的圖。
[0076] [圖5]圖5是顯示利用木糖作為碳源時生長試驗結果（比生長速率）的圖。
[0077][圖6]圖6是顯示利用木糖作為碳源時發酵試驗結果（木糖和乙醇隨時間變化） 的圖。
[0078][圖7]圖7是顯示利用木糖作為碳源時發酵試驗結果（72小時內木糖消耗量）的 圖。
[0079][圖8]圖8是顯示利用木糖作為碳源時發酵試驗結果（72小時內木糖消耗量）的 圖。
[0080] [圖9]圖9是對利用木糖作為碳源的多種變異株顯示發酵試驗結果（72小時內木 糖消耗量）的圖A至D。
[0081] 實施方案的詳述
[0082] 下文的公開內容涉及一種新的XI，所述XI與RsXI即源自黃胸散白蟻腸內原生生 物的木糖異構酶具有某些關系并且可用于增強真核細胞如酵母的木糖利用能力。發明人已 經發現針對RsXI發現的有效增強酵母的木糖利用能力的置換突變還相對于另一種XI而言 有效增強真核細胞的木糖利用能力。將與RsXI具有共同基序的另一種XI視為具有與RsXI 相似的功能的XI。在真核細胞中表達修飾的XI情況下，其中向基序中的天冬酰胺引入置換 突變，可以顯示木糖異構酶活性并且可以改善宿主真核細胞的木糖利用能力。下文將適當 參考附圖詳細描述當前說明書的公開內容。
[0083] (具有木糖異構酶活性的蛋白質）
[0084] 與RsXI的SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列比對時，本發明的蛋白質可以包括1個 或2個或更多個下文描述的第1基序至第6基序（SEQIDN0:2至7)。第1基序至第6基 序可以從氨基酸序列N端側按所述順序含于本發明的蛋白質中。
[0085] 全部基序均存在于RsXI中，并且根據與這類其他XI的多重比對結果，發明人通過 基序分析還在其他XI中找到了這些基序。
[0086] 本發明的蛋白質含有優選地第1基序至第6基序中的至少第6基序。該蛋白質優 選地還含有第4基序，更優選地還含有第5基序，仍然更優選地還含有第3基序，甚至更優 選地還含有第1基序，并且仍然甚至更優選地還含有第2基序。
[0087] 在基序分析中，通過蛋白質BLAST(數據庫：非冗余蛋白質序列，Algorism參數：默 認設置）查找到RsXI的氨基酸序列。相對于其他前500個類似氨基酸序列和RsXI的氨基 酸序列，進行比對分析。從比對分析的結果，將6個特征性結構域的共有序列定義為基序序 列。
[0088] 作為類似氨基酸序列的這類其他XI命中的例子包括圖1中所示的在酵母中具有 活性的10種XI。XI與RsXI的SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列的同一性是46%至63%并 且不是特別地高，然而，這些XI共同具有第1基序至第6基序并且與SEQIDNO: 1中的相 應基序具有高的同一性。可以使用SEQIDNO: 1表示的RsXI的氨基酸序列，在公眾已知的 數據庫中找到這類其他XI。
[0089] 圖2中顯示了通過多重比對SEQIDNO: 1表示的氨基酸序列和圖1中所示10種 XI的氨基酸序列（SEQIDN0:14至23)的序列標志分析和基序分析的結果以及就每個基 序而言的同一性。在圖2中按同一性百分數的遞降順序描述同一性。圖3顯示RsXI和其 他10種XI的多重比對分析結果。圖4顯示就其他在酵母中具有活性的XI的每個基序而 言的同一,性。
[0090] 本領域技術人員可以通過使用各種公眾已知的數據庫如蛋白質BLAST(其是前述 的公眾已知數據庫），執行多重比對。對用于多重比對的技術或用于獲得共有序列的技術不 存在具體限制并且可以使用多種技術，如ClustalW:http://align.genome,j