(2.5mM)濃度(0.4-1.2 μ L)進行了優化，確定了試劑盒中各成分的最佳體系(ImL檢測溶液)為:包括ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包括:1.2 μ M正向內引物FIP，1.2 μ M反向內引物ΒΙΡ，
0.3μΜ正向外引物F3，0.3μΜ反向外引物B3，60yL 1XThermoPol Buffer, 1.5mM MgCl2,
1.0mM dNTPs, 0.2M甜菜堿，1.5mM羥基溴酚藍(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入無菌超純水制備得到，100次包裝，低溫運輸，_20°C保存，有效期I年。
[0052]其中各引物序列具體如下:
[0053]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0054]BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0055]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0056]B3:5’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0057]實施例3 LAMP反應參數優化
[0058]為了得到最適的反應溫度和時間，保證該檢測方法的高效性，當時間設為60min，對反應溫度52-68°C進行優化；當溫度設為60°C，對反應時間15-120min進行優化；經過觀察顏色變化及凝膠電泳梯狀條帶，得出在反應溫度為59-61°C (圖1，圖2)和反應時間為45?120min(圖3，圖4)時均能實現LAMP擴增。
[0059]實施例4 LAMP反應特異性試驗
[0060]以灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑的敏感菌株BT3-17、野生抗性基因型G143A菌株BT13-15和NJ5-1、灰葡萄孢菌SDHB_H272R菌株B29、核盤菌HA61、禾谷鐮刀菌2021等不同抗性基因型及病原菌為供試材料，進行LAMP反應。取上述供試菌株的DNA溶液I μ L，加入10 μ L實施例2制備的檢測溶液進行LAMP反應，反應程序是60°C 60min。結果顯示基于反應體系顏色反應作為結果判定標準，當DNA模板為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株時，呈現天藍色；當模板為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑非抗性菌株時，呈現紫色(圖5);同時用凝膠成像系統進行檢測時，陽性出現梯狀DNA條帶，陰性無條帶(圖6)。
[0061]實施例5 LAMP反應靈敏度試驗
[0062]為了確定LAMP反應的檢測下限，將灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性基因型G143A菌株的含有第143位突變位點的DNA片段克隆至載體PEASY-T3上，轉化大腸桿菌，挑取陽性轉化子，提取質粒后，測定其濃度，計算拷貝數，以10倍梯度稀釋作為模板。分別取10倍稀釋后的各濃度DNA稀釋液I μ L作為模板進行PCR擴增，同時以上述稀釋液I μ L作為模板，加入9 μ L實例2制備的檢測溶液進行LAMP擴增，反應程序為60°C 60min。HNB顯色反應表明LAMP反應的最低檢測下限為14拷貝數；同時分別取PCR和LAMP擴增產物3 μ L上樣，在3%瓊脂糖凝膠上電泳，結果顯示LAMP的檢測下限是普通PCR的100倍。
[0063]實施例6 LAMP反應重復性試驗
[0064]為了測定LAMP的穩定性和重復性，本發明對經過測序驗證的13個灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株的基因組DNA為模板進行LAMP檢測，以野生型作為陰性對照。取上述供試菌株的DNA溶液I μ L，加入9 μ L實施例2制備的檢測溶液進行LAMP反應，反應程序是60°C 60mino結果顯示基于反應體系顏色反應作為結果判定標準，當DNA模板為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株時，呈現天藍色；當模板為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑非抗性菌株時，呈現紫色(圖7);同時用凝膠成像系統進行檢測時，陽性出現梯狀DNA條帶，陰性無條帶(圖8)。上述結果表明該鑒定方法結果可靠，重復性好。
[0065]實施例7從田間采集的灰葡萄孢菌菌株中檢測對QoI類殺菌劑的抗性菌株
[0066]實施例2中的檢測試劑盒用于檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的方法，包括:
[0067]I)田間灰葡萄孢菌的采集與分離。
[0068]2)采用CTAB法提取分離菌株的DNA，4°C保存備用，用于LAMP擴增的模板。
[0069]3)LAMP檢測:包括:灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性基因型G143A的檢測:取I yLDNA溶液，加入9 μ L的檢測溶液進行LAMP反應，反應程序是60°C 60min。以HNB作為反應指示劑，擴增結束后LAMP反應體系的顏色呈現天藍色，以此判斷田間采集的菌株為QoI類殺菌劑抗性菌株。
【主權項】
1.一種用于檢測灰葡萄孢菌對Q0I類殺菌劑抗性的LAMP檢測引物組合物:有正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3組成；各引物序列具體如下:FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；B3:5’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。2.權利I所述的LAMP檢測引物組合物在檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性中的應用。3.一種檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:包括ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包括:1.2 μ M正向內引物FIP，1.2 μ M反向內引物ΒΙΡ，0.3 μΜ正向外引物F3，0.3 μΜ反向外引物B3，60 yL 1XThermoPol Buffer, 1.5mM MgCl2,1.0mM dNTPs，0.2M甜菜堿，1.5mM羥基溴酚藍(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入無菌超純水制備得到；其中，各引物序列如下:FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；B3:5’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。4.權利要求3所述的LAMP檢測試劑盒在檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性中的應用。5.一種檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法，其特征在于:包括提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行LAMP擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察結果，若存在梯狀條帶，則證明所檢測的灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑抗性菌株；若無梯狀條帶，則證明所檢測灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑敏感菌株；或觀察LAMP反應溶液顏色變化，若為天藍色，判定為QoI類殺菌劑抗性菌株；若為紫色，判定為QoI類殺菌劑敏感菌株。6.根據權利要求5所述的灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法，其特征在于:提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，取I μ L DNA溶液，加入9 μ L試劑盒中的檢測溶液進行LAMP，LAMP 反應參數為 59-61 °C 60min，80°C 1min0
【專利摘要】本發明公開了一種基于環介導恒溫擴增技術快速檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的方法及引物組合物。該LAMP檢測引物組合物由正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3組成。本發明的檢測方法簡便易行、實用性好、靈敏度高、特異性強、準確性高、實現了恒溫擴增，為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的檢測提供了新的技術平臺，能夠對灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑抗性群體進行監測，及時了解抗性群體發展動態。本發明為作物灰霉病的抗性治理和對減少農藥的環境污染、降低農業生產成本也具有重要的現實意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/645, C12N15/11
【公開號】CN105132556
【申請號】CN201510570028
【發明人】段亞冰, 周明國, 陳長軍, 楊瑩, 王建新, 張曉柯
【申請人】南京農業大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月8日