一種快速檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的方法及引物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及基于環介導恒溫擴增技術檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性基因型G143A菌株的方法及引物組合物；可用于灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性群體發展的動態監測與抗性風險評估，為作物灰霉病的抗性預警、抗性治理及合理用藥提供科學指導。
【背景技術】
[0002]由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病，是一種重要的世界性病害。該病害寄主廣泛，可侵染235余種植物，在我國各地均有發生，它不僅侵染果實，也侵染莖、葉、花，還會引起大棚蔬菜上的果實腐爛，可造成產量損失20-30%，局部減產達到70%以上，嚴重時甚至是絕收，從而造成嚴重的經濟損失。由于缺少有效的抗灰霉病品種，灰葡萄孢菌寄主專化性弱、產孢量大、傳播速度快、極易產生遺傳變異性，因此，目前灰霉病的防治仍以化學防治為主。該方法見效快，防效高，操作簡便，能有效的減少灰霉病的發生與發展，降低經濟損失，成為防控該病害的關鍵措施之一。但是隨著單一殺菌劑使用年限的增長、藥劑使用不規范及藥劑劑量的增大，田間抗性菌株也不斷出現，且呈現出逐年增加的趨勢。根據國內外研究報道，灰葡萄孢菌已對很多常用殺菌劑產生了抗性，如苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯胺基嘧啶類、N-苯基氨基甲酸酯類、甲氧基丙烯酸酯類(QoIs)和琥珀酸脫氫酶類(SDHIs)等殺菌劑。隨著灰霉病抗性問題日益突出，灰霉病的抗藥性監測對抗性流行性預警及田間合理用藥具有重要指導作用。檢測或監測灰葡萄孢菌對殺菌劑的抗藥性，通常是通過單孢分離菌株后采用菌絲生長法、孢子萌發法及微孔板法，然而這些傳統的檢測方法檢測周期較長，從分離到鑒定長達I周，檢測效率低，且在病原菌培養過程中存在雜菌污染，給實驗結果帶來誤差；同時，還需投入大量的人力資源，增加檢測成本。
[0003]近年來，隨著核酸相關分子檢測技術的發展，PCR技術為植物病原菌的抗藥性檢測提供了快速、靈敏、準確的優勢，但是檢測需要昂貴的實驗儀器及繁瑣的電泳過程，檢測時間長，檢測成本高昂等，不能滿足經濟高效檢測的需求，并且在鑒定過程中還需要接觸大量有毒有害試劑，對實驗操作人員存在較大的安全隱患。因此，開發對植物病原菌抗藥性檢測的新技術已迫在眉睫。
[0004]環介導恒溫擴增反應(LAMP)是日本學者Notomi等發明的一種新穎的恒溫核酸體外擴增技術，廣泛應用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術原理是:利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60?65°C范圍30-80min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生。羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據反應液中鎂離子的變化而呈現出不同的顏色，陰性(沒有擴增出產物)時為紫色，陽性(有產物擴增)時為天藍色。LAMP方法的最大特點就是實現恒溫擴增，不需要循環儀、凝膠成像系統等昂貴的儀器；擴增反應極快，一般在I小時內完成；擴增產生的產物量大，通過肉眼即可判定結果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于病原突變基因型的快速鑒定及檢測。
[0005]已有研究表明，細胞色素b(cyt b)第143位是大多數病原體Qo抑制劑的一個結合位點。由于灰葡萄孢菌cty b基因存在結構多樣性，在第143/144位氨基酸之間有內含子插入，也有無內含子插入的結構。其中，敏感菌株在這兩種結構中均存在，抗性菌株僅出現在第143/144位氨基酸之間均沒有內含子插入的結構中。在灰葡萄孢菌中，其對QoI類殺菌劑的抗性主要是通過對病原菌進行單基因突變，將cyt b基因第143位甘氨酸(G)變為丙氨酸(A)后，使得對QoI類殺菌劑表現出高抗。目前，這也是在灰葡萄孢菌中報道的唯一的QoI類殺菌劑抗性基因型。
[0006]本發明中，依據灰葡萄孢菌cyt b基因第143位氨基酸突變基因型(GGT — GCT)，基于環介導恒溫擴增技術(LAMP)建立了灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的快速分子檢測技術。該檢測技術具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點，能大大提高檢測效率，對灰霉病的抗藥性檢測、抗藥性流行預警具有重要的現實意義。然而，經檢索目前國內外尚未有灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP快速分子檢測的相關報道。
【發明內容】
[0007]發明目的:針對已有灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性鑒定方法中存在費時、費力、成本高、準確性低等缺點及PCR檢測技術需要昂貴的熱循環儀器和繁瑣的電泳操作過程，無法達到快速檢測的需要。本發明的目的是提供一種灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測引物組合物及基于LAMP技術提供一種快速分子檢測方法，該方法具有檢測周期短、準確性和靈敏度高、肉眼可以直接觀察檢測結果等諸多優點。
[0008]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為:
[0009]一種用于檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測引物組合物:有正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3組成；各引物序列具體如下:
[0010]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0011 ] BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0012]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0013]B3:5 ’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0014]所述的LAMP檢測引物組合物在檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性中的應用。
[0015]一種檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒:包括ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包括:1.2μΜ正向內引物FIP，1.2μΜ反向內引物ΒΙΡ，0.3μΜ正向外引物 F3，0.3 μΜ 反向外引物 B3，60 yL 1XThermoPol Buffer, 1.5mM MgCl2,1.0mM dNTPs，
0.2M甜菜堿，1.5mM羥基溴酚藍(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入無菌超純水制備得到；其中，各引物序列如下:
[0016]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0017]BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0018]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0019]B3:5 ’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0020]所述的灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒在檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性中的應用。
[0021]一種檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法:包括提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行LAMP擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察結果，若存在梯狀條帶，則證明所檢測的灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑抗性菌株；若無梯狀條帶，則證明所檢測灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑敏感菌株；或觀察LAMP反應溶液顏色變化，若為天藍色，判定為QoI類殺菌劑抗性菌株；若為紫色，判定為QoI類殺菌劑敏感菌株。
[0022]所述的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法:提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，取I μ L DNA溶液，加入9 μ L試劑盒中的檢測溶液進行LAMP，LAMP反應參數為59-610C 60min，80°C 1min0
[0023]本發明的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法，包括提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用所述的LAMP引物組合物進行LAMP ;擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察結果(羥基溴酚藍不會影響電泳結果)，若存在梯狀條帶，所檢測的灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑抗性菌株；若無梯狀條帶，則證明所檢測灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑敏感菌株。羥基溴酚藍(HNB)是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監測LAMP反應體系中Mg2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應前將HNB加入到反應液中，反應體系呈紫色，反應過程中Mg2+與LAMP