反應的副產物P2O74結合產生大量沉淀，溶液中Mg 2+濃度降低，pH發生變化，從而使HNB的顏色由紫色變為天藍色。因此，反應結束后通過反應體系的顏色變化，來判斷是否為灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑抗性菌株:天藍色表示檢測為陽性，是灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑抗性菌株；紫色表示檢測結果為陰性，是灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑敏感菌株。
[0024]本發明的關鍵性技術之一是根據灰葡萄孢菌cyt b基因第143位氨基酸密碼子GGT (Gly) — GCT(Ala)的突變來設計和優選出的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證能鑒定出灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑抗性基因型G143A的特異性引物序列，本發明分別選取灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑的敏感菌株、抗性基因型G143A菌株、核盤菌和禾谷鐮刀菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株的DNA。具體方法如下:取少量菌絲，加500 μ L 2% CTAB提取液在球磨儀中研磨2min，加入等體積的苯酸-氯仿-異戊醇(25: 24:1)，顛倒混勾后，12000rpm離心5min ;取上清于新離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，12000rpm離心5min ;棄上清，沉淀用70%酒精洗滌，風干，加適量無菌蒸饋水溶解沉淀，4°C保存備用。該DNA提取方法在30min內即可提取到菌絲中的DNA。
[0025]當LAMP進行反應擴增時，產生大量的焦磷酸鎂白色沉淀導致反應液的濁度上升，通過HNB的顯色反應結果所示，灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑抗性菌株反應管均為天藍色，其為陽性結果，而灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑敏感菌株、其它抗性基因型和其它病原菌的抗性基因型等陰性對照反應管均為紫色，為陰性結果，證明設計和優選的LAMP引物組合物具有特異性。同時，反應產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察擴增的反應產物，灰葡萄孢菌的QoI類殺菌劑抗性菌株出現了典型的梯狀條帶，而其它陰性對照無梯狀條帶。這說明該LAMP引物組合物可被用于灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株快速可靠的試劑盒鑒定，為灰葡萄孢菌的抗性監測及抗性評估提供理論基礎和技術支撐，對我國作物灰霉病的發生流行和抗性治理具有重要的理論指導意義。
[0026]本發明提供的快速檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的分子生物學方法，具有靈敏度高，特異性強等特點，與現有技術相比，本發明的有益結果是:
[0027]1、簡便易行:本發明提供的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP方法克服了現有檢測方法所需周期長、費時費力、繁瑣、特異性差的問題及PCR檢測技術需要熱循環儀器，不能實現快速檢測的問題。本發明在59?ere的任一等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株，不需要復雜和昂貴的儀器，能較好滿足對抗性菌株的現場檢測。
[0028]2、實用性好:PCR檢測方法需要進行凝膠電泳，很容易造成產物擴散，成為實驗室氣凝膠污染的一個主要來源；而且溴化乙錠(EB)有毒，可累積致癌；長期觀察紫外燈也會對實驗人員造成一定程度的傷害。而LAMP反應只需在恒溫水浴鍋中進行，可以直接通過顏色變化即可直接判斷結果，省去了昂貴的儀器設備及繁瑣的電泳過程，增加了在農業生產中抗性監測的應用價值。
[0029]3、恒溫擴增:本發明提供的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP方法，不像PCR法必須要熱循環儀，這樣就擺脫了對熱循環儀的依賴，只要有穩定的熱源LAMP反應就可以發生，極大的擴展了 LAMP使用的范圍，LAMP之所以能在恒定的熱源下發生反應是因為在LAMP反應液中添加了甜菜堿，使雙鏈DNA處于解鏈的動態平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下實現擴增。
[0030]4、靈敏度高:將構建的質粒載體稀釋成不同的濃度，作為模板，分別用LAMP法和PCR法進行靈敏度檢測，本發明提供的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP方法檢測下限為14拷貝數，是普通PCR的100倍；
[0031]5、特異性強:本發明在設計和優選引物時，對灰葡萄孢菌cyt b基因的143位的突變位點上嘗試了多種堿基的錯配，最終優選出一套能特異性鑒定灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP引物組合物，該方法通過2對引物特異性識別靶序列上的6個獨立區域，相對于PCR引物識別靶序列的2個獨立區域而言，特異性大大提高，假陽性出現的概率也隨之降低；
[0032]6、準確性高:該方法幾乎不受反應混合液中存在的大量外源DNA和雜質的影響，不需要從樣本中純化DNA，可直接利用發病組織提取DNA進行快速檢測，大大提高檢測準確度；
[0033]7、本發明為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的檢測提供了新的技術平臺，可用于灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的快速檢測，是國內外首次利用LAMP技術檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株，這種方法簡便快捷，對抗性菌株的準確診斷、及時了解抗性群體發展動態、指導科學用藥、降低成本及減少環境污染具有重要的現實意義。
【附圖說明】
[0034]圖1是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP反應溫度優化顏色顯色圖。
[0035]圖2是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP反應溫度優化凝膠電泳圖。
[0036]圖3是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP反應時間優化顏色顯色圖。
[0037]圖4是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP反應時間優化凝膠電泳圖。
[0038]圖5是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP特異性顏色顯色圖。其中，1:灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑的敏感菌株BT3-17 ;2-3:野生抗性菌株BT13-15和NJ5-1 ;4:灰葡萄孢菌對SDH類殺菌劑的抗性菌株B29 ;5:核盤菌HA61 ;6:禾谷鐮刀菌2021 ;7:陰性對照ddH20。
[0039]圖6是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP特異性凝膠電泳圖。其中M為DNA Marker ；1:灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑的敏感菌株BT3-17 ;2_3:野生抗性菌株BT13-15和NJ5-1 ；4:灰葡萄孢菌對SDH類殺菌劑的抗性菌株B29 ；5:核盤菌HA61 ；6:禾谷鐮刀菌2021 ；7:陰性對照ddH20。
[0040]圖7是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP重復性顏色顯色圖。其中，I為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑敏感菌株，2-14均為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株。
[0041]圖8是灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性檢測的LAMP重復性凝膠電泳圖。其中，M為DNA Marker ; I為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑敏感菌株，2-14均為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性菌株。
【具體實施方式】
[0042]實施例1 LAMP反應引物組合物的特異性實驗
[0043]為了驗證LAMP反應引物組合物的特異性，以灰葡萄孢菌cyt b基因(AB262969.1)第143位氨基酸密碼子GGT (Gly) — GCT (Ala)的突變為依據，設計LAMP引物，其突變位點位于正向內引物FIP的3’端，在突變位點上下游各3個堿基間進行任一或任二堿基進行錯配突變，共設計7套LAMP引物，以灰葡萄孢菌敏感菌株和灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性基因型G143A菌株的DNA為模板進行LAMP實驗，優選出能特異性檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP引物組合物。
[0044]各引物序列具體如下:
[0045]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0046]BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0047]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0048]B3:5’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0049]其中，在正向內引物FIP的3’端堿基中，加粗的“C”堿基為灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性基因型G143A的點突變堿基。
[0050]實施例2 LAMP反應體系及檢測試劑盒體系優化
[0051]為了節省鑒定成本，保證該鑒定方法的穩定性和可靠性，對反應體系中Bst DNA聚合酶(8U/ μ L) (0.8-4.0U)、Mg2+ (25mM)濃度(0.6-2.0 μ L)、弓丨物 FIP/BIP (40 μ Μ)及F3/B3 (10 μ Μ)濃度(0.1-0.5 μ L)，甜菜堿(8Μ)濃度(0.4-2.0 μ L)、HNB