、懸浮劑、糖漿或薄片劑（wafer)。就注射劑而言， 可以將長效制劑配制到單劑量安瓿或多劑量容器中。還可以將長效制劑配制成溶液、懸浮 液、片劑、膠囊劑和緩釋制劑。
[0062] 適于制劑的載體、賦形劑和稀釋劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽/酯、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖 維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸鹽/酯、丙基羥基苯 甲酸鹽/酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，制劑可進一步包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、保 濕劑、芳香劑和防腐劑。
[0063] 本發明的長效制劑可以由若干相關因素確定，包括待治療疾病的類型、施用途徑、 患者年齡、性別、體重和病情的嚴重程度以及作為活性組分的藥物的類型。由于本發明的藥 物組合物具有極佳的體內持續時間或效價，所以它能夠極大地降低本發明的藥物的施用頻 率和劑量。
[0064] 本發明的長效制劑將胰島素的體內持續時間和穩定性維持在非常高的水平，并因 此有效地用于治療胰島素依賴型糖尿病。
[0065] 在又一方面，本發明提供了用于制備胰島素綴合物的方法，其包括以下步驟：
[0066] (1)將在其每一端具有醛、馬來酰亞胺基或琥珀酰亞胺衍生物反應性基團的非肽 基聚合物與免疫球蛋白Fc區的胺基或巰基共價連接；
[0067] (2)從（1)的反應混合物中分離綴合物，其中所述綴合物包含與非肽基聚合物共 價連接的免疫球蛋白Fc區；以及
[0068] (3)將胰島素與所分離的綴合物中非肽基聚合物的另一端共價連接，從而生成包 含連接到非肽基聚合物兩端的免疫球蛋白Fc區和胰島素的肽綴合物。
[0069] 優選地，步驟（1)的非肽基聚合物在其末端具有反應性醛衍生物，更優選三個反 應性醛基。
[0070] 在又一方面中，本發明提供了用于制備胰島素綴合物的方法，其包括以下步驟：
[0071] (1)在pH 6.0下，將在其每一端具有醛反應性基團的非肽基聚合物與免疫球蛋白 Fc的N-端共價連接；
[0072] (2)從⑴的反應混合物中分離綴合物，其中所述綴合物包含其在N-端與非肽基 聚合物共價連接的免疫球蛋白Fc區；以及
[0073] (3)將胰島素與所分離綴合物中非肽基聚合物的另一端共價連接，從而生成包含 連接到非肽基聚合物兩端的免疫球蛋白Fc區和胰島素的肽綴合物。
[0074] 在又一方面中，本發明提供了用于制備胰島素綴合物的方法，其包括以下步驟：
[0075] (1)將在其每一端具有醛、馬來酰亞胺或琥珀酰亞胺衍生物反應性基團的非肽基 聚合物與胰島素的胺基或巰基共價連接；
[0076] (2)從（1)的反應混合物中分離綴合物，其中所述綴合物包含與非肽基聚合物共 價連接的胰島素；以及
[0077] (3)將免疫球蛋白Fc區與所分離綴合物中非肽基聚合物的另一端共價連接，從而 生成包含連接到非肽基聚合物兩端的免疫球蛋白Fc區和胰島素的肽綴合物。
[0078] 在又一方面中，本發明提供了用于制備胰島素綴合物的方法，其包括以下步驟：
[0079] (1)將在其每一端具有醛反應基團的非肽基聚合物與胰島素的胺基共價連接；
[0080] (2)從（1)的反應混合物中分離綴合物，其中所述綴合物包含與非肽基聚合物共 價連接的胰島素；以及
[0081] (3)將免疫球蛋白Fc區與所分離綴合物的非肽基聚合物的另一端共價連接，從而 生成包含連接到非肽基聚合物兩端的免疫球蛋白Fc區和胰島素的肽綴合物。
[0082] 在又一方面中，本發明提供了治療具有胰島素缺陷病癥之對象的方法，該方法包 括向對象施用有效量的長效制劑。優選地，胰島素缺陷病癥是糖尿病。
[0083] 本文所使用的對象可以是哺乳動物，例如，人、非人靈長類動物、馬、綿羊、貓、狗、 牛或豬。
[0084] 實施例
[0085] 在下文中，可以通過給出以進行說明的下述實施例獲得對本發明的更好的理解， 但不應解釋為限制本發明。
[0086] 實施例L聚乙二醇化免痔球蛋白Fc岡的純化
[0087] 對于免疫球蛋白Fc在其N-端的聚乙二醇化，使用5K PropionALD(3)PEG(具有3 個丙醛基的PEG，NOF，Japan)，通過在4°C下將免疫球蛋白Fc與PEG以1 : 2的摩爾比反應 4. 5小時進行聚乙二醇化，免疫球蛋白Fc濃度為10mg/ml。此時，反應在pH 6. 0的IOOmM 磷酸鉀緩沖液中進行，并向其中添加20mM SCB(NaCNBH3)作為還原劑。使用Sourcel5Q柱 (GE Healthcare)從反應溶液中純化單聚乙二醇化的免疫球蛋白Fc。
[0088] 實施例2.腠島素-PEG-免痔球蛋白Fe綴合物的制備
[0089] 為了制備在胰島素 β鏈的苯丙氨酸（BlF)處具有90%或更高聚乙二醇化的胰島 素-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物，在4°C下將實施例1中得到的單聚乙二醇化免疫球蛋白Fc 與胰島素以4 : 1的摩爾比反應20小時，總蛋白質濃度為20mg/ml。此時，反應在pH 6. O 的IOOmM磷酸鉀緩沖液中進行，并向其中添加20mM SCB作為還原劑。反應終止之后，使用 Sourcel5Q柱對反應溶液進行初次純化。然后，使用Source 15IS0柱進行二次純化以得到 胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物。使用尺寸排阻柱分析所得胰島素-PEG-免疫球蛋白 Fc綴合物的BlF的90%或更高的聚乙二醇化，結果顯示于圖3。
[0090] 實施例 3.賴脯腠島素 （Insulin lispro) -PEG-免痔球蛋白 Fc 綴合物的制備
[0091] 在4°C下將實施例1中得到的單聚乙二醇化免疫球蛋白Fc與賴脯胰島素以4 : 1 的摩爾比反應20小時，總蛋白質濃度為20mg/ml。此時，反應在pH 6. 0的IOOmM磷酸鉀緩 沖液中進行，并向其中添加20mM SCB作為還原劑。反應終止之后，以與實施例2中相同的 方法進行純化。
[0092] 4. (Insulin glargine) ( ) _PEG_ 免疫球蛋白 Fe 綴合物的制備
[0093] 在4°C下將實施例1中得到的單聚乙二醇化免疫球蛋白Fe與甘精胰島素以4 : 1 的摩爾比反應20小時，總蛋白質濃度為20mg/ml。此時，反應在pH 6. 0的IOOmM磷酸鉀緩 沖液中進行，并向其中添加20mM SCB作為還原劑。反應終止之后，以與實施例2中相同的 方法進行純化。
[0094] 實施例 5.地,特腠島素 （Insulin detemir) ( LeVCIIli) _PEG_ 免疫球蛋白 Fe 綴合物的制備
[0095] 在4°C下將實施例1中得到的單聚乙二醇化免疫球蛋白Fc與地特胰島素以4 : 1 的摩爾比反應20小時，總蛋白質濃度為20mg/ml。同時，該反應在pH 6. 0的IOOmM磷酸鉀 緩沖液中進行，并向其中添加20mM SCB作為還原劑。反應終止之后，以與實施例2中相同 的方法進行純化。
[0096] 實施例6.長效腠島素綴合物的體內清除半衰期的測量
[0097] 為了分析長效胰島素綴合物的體內持續時間，使用正常雄性SD大鼠進行藥代動 力學分析。用天然胰島素和長效胰島素綴合物以100 μ g/kg劑量（基于胰島素）皮下注 射正常雄性SD大鼠一次，然后使用ELISA試劑盒測量血清水平的時間依賴性變化。使用 Winnolin 5. 2軟件從所測量的值計算藥代動力學參數。長效胰島素綴合物的體內清除半衰 期為17. 67小時，其比天然胰島素的0. 58小時長約30倍（圖1)。
[0098] 實施例7.腠島素衍牛物的綴合物的體內效力測試
[0099] 為了比較胰島素衍生物的綴合物的體內效力，使用鏈脲佐菌素誘導型糖尿病大鼠 分析其降血糖作用。正常大鼠禁食16小時，并用IOmM檸檬酸緩沖液（pH 4.5)中的鏈脲佐 菌素以60mg/kg劑量進行腹膜內注射以誘導糖尿病。當大鼠的血糖水平達到500mg/dL或 更高時，用胰島素綴合物、地特胰島素綴合物或賴脯胰島素綴合物以0. 5mg/kg劑量皮下注 射大鼠一次，然后比較它們的降血糖作用。胰島素綴合物和賴脯胰島素綴合物的降血糖作 用維持了注射后約4天，注射后5天血糖水平增加。地特胰島素綴合物也示出降血糖作用， 但在等劑量下其作用低于胰島素綴合物或賴脯胰島素綴合物（圖2)。
[0100] 實施例8.腠島素-5K PEG-免痔球蛋白Fc綴合物的結合位點的鑒宙
[0101] 為了鑒定胰島素與5K PEG-免疫球蛋白Fc的結合位點，進行Glu-C作圖 (mapping)。將20yg胞內蛋白酶Glu-C(lmg/ml)加入IOOyg胰島素-5K PEG-免疫球蛋 白Fc(lmg/ml)中。反應溶液為pH 7.5的50mM HEPES，將混合物在25°C下反應8小時。然 后，添加1〇μ1的IN HCL終止反應。通過反相HPLC色譜進行作圖。結果示出胰島素 β鏈 的N-端的峰變化，表明5Κ PEG-免疫球蛋白Fc與胰島素 β鏈的N-端結合（圖4a-c)。
[0102] 柱：Jupiter C18 4. 6X 250mm，5 μ m(Phenomenex)
[0103] 流動相 A :20% 0· IM NaS04(pH 2· 0)，10% CAN
[0104] 流動相 B :20% 0· IM NaS04(pH 2. 0)，40% CAN
[0105] 梯度：10分鐘內0% B > 5分鐘內0-10% B > 60分鐘內10-70% B
[0106] 以下內容對應于母案申請中的原始權利要求書，現作為說明書的