個免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fe區具有相對低的分子量，因此在綴合物 的制備、純化和生產上是有利的。由于免疫球蛋白Fe區不包含Fab片段（其氨基酸序列根 據抗體亞類而不同并且因此是高度不均一的），因此可以預期免疫球蛋白Fe區可極大地增 加物質的均一性并具有低抗原性。
[0039] 本文所使用的術語"免疫球蛋白Fe區"是指含有免疫球蛋白的重鏈恒定區2(CH2) 和重鏈恒定區3(CH3)，而不含免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區、重鏈恒定區I(CHl)和輕 鏈恒定區I(CLl)的蛋白質。它還可包含重鏈恒定區處的鉸鏈區。此外，本發明的免疫球蛋 白Fe區可含有包含除了重鏈和輕鏈的可變區以外的重鏈恒定區I(CHl)和/或輕鏈恒定 區I(CLl)的Fe區的一部分或全部，只要它具有與天然蛋白質基本相似或更好的生理功能 即可。此外，它可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相對長的部分中具有缺失的片段。 即，本發明的免疫球蛋白Fe區可包含I) CHl結構域、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域； 2) CHl結構域和CH2結構域；3) CHl結構域和CH3結構域；4) CH2結構域和CH3結構域；5) - 種或更多種結構域與免疫球蛋白鉸鏈區（或鉸鏈區的一部分）的組合以及6)重鏈恒定區 和輕鏈恒定區的各個結構域的二聚體。
[0040] 此外，本發明的免疫球蛋白Fe區包括天然氨基酸序列及其序列衍生物（突變體）。 由于一個或更多個氨基酸殘基的缺失、插入、非保守或保守替換或其組合，氨基酸序列衍生 物具有與天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fe中，第214至238、297至299、318至 322或327至331位處的已知對于結合重要的氨基酸殘基可用作修飾的適合靶點。此外，其 它多種衍生物也可以，包括其中缺失了能夠形成二硫鍵的區域的、缺失了天然Fe形式N-端 處數個氨基酸殘基的或者向天然Fe形式的N-端添加了甲硫氨酸殘基的衍生物。此外，為 了去除效應子功能，缺失可發生于補體結合位點，如Clq結合位點和ADCC位點。制備這樣 的免疫球蛋白Fe區的序列衍生物的技術公開于WO 97/34631和WO 96/32478中。
[0041] 蛋白質和肽中一般不改變分子活性的氨基酸替換是本領域已知的（H.Neurath， R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常發生的替換是 Ala/Ser、 Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/ Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly，雙向皆可。
[0042] 如果需要，Fe區可以通過磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化 (famesyIation)、乙酰化、酰胺化等進行修飾。
[0043] 上述Fe衍生物是與本發明的Fe區具有相同生物活性或者改善的結構穩定性（例 如對熱、PH等的結構穩定性）的衍生物。
[0044] 此外，這些Fe區可以得自從人和包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠的 其他動物中分離的天然形式，或者可以是得自轉化的動物細胞或微生物的其重組體或衍生 物。在本文中，它們可通過從人或動物有機體分離完整的免疫球蛋白并用蛋白水解酶對它 們進行處理而從天然免疫球蛋白獲得。木瓜蛋白酶將天然免疫球蛋白消化成Fab區和Fe 區，而胃蛋白酶處理則導致產生pF' c和F(ab)2片段。例如，可對這些片段進行尺寸排阻 層析以分離Fc或pF' C0
[0045] 優選地，人源性（human-derived)Fc區是獲得自微生物的重組免疫球蛋白Fc區。
[0046] 此外，本發明的免疫球蛋白Fc區可以是具有天然糖鏈、與天然形式相比糖鏈增加 或與天然形式相比糖鏈減少的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖鏈的增 加、減少或去除可以通過本領域中常用方法完成，如化學法、酶促法和利用微生物的遺傳工 程方法。從Fc片段去除糖鏈導致與補體（Clq)的結合親和力明顯降低和抗體依賴性細胞 介導的細胞毒性或補體依賴性細胞毒性的降低或喪失，從而不會誘導不必要的體內免疫應 答。鑒于此，去糖基化或未糖基化形式的免疫球蛋白Fc區可更適于本發明的目的以作為藥 物載體。
[0047] 本文所使用的術語"去糖基化"意指從Fc區酶促地去除糖部分，而術語"未糖基 化"意指Fc區是以無糖基化形式由原核動物（優選大腸桿菌）產生的。
[0048] 此外，免疫球蛋白Fc區可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc區，或者通 過其組合或雜合制備而成。優選地，其衍生自IgG或IgM(它們是人類血液中最豐富的蛋白 質之一），最優選衍生自IgG(已知其延長配體結合蛋白質的半衰期）。
[0049] 本文所使用的術語"組合"意指編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不 同來源的單鏈多肽連接從而形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可以由選自以下的 兩種或更多種片段形成：IgG Fc片段、IgA Fc片段、IgM Fc片段、IgD Fc片段和IgE Fc片 段。
[0050] 本文所使用的術語"雜合"意指編碼兩種或更多種不同來源的免疫球蛋白Fc區的 序列存在于單鏈免疫球蛋白Fc區中。在本發明中，可以有多種類型的雜合。即，結構域雜 合可以由選自 IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc 和 IgD Fc 的 CH1、CH2、CH3 和 CH4 中的一至 四個結構域構成，并且可包含鉸鏈區。
[0051] 另一方面，IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型，本發明包括其組合或雜合。優 選IgG2和IgG4亞型，最優選IgG4的Fc區，它幾乎不具有的效應子功能如⑶C (補體依賴 性細胞毒性）。
[0052] 作為本發明的藥物載體，最優選的免疫球蛋白Fc區是人IgG4來源的非糖基化Fc 區。與非人源性Fc區相比，更優選人源性Fc區，因為非人源性Fc區可在人體內作為抗原 并引起不期望的免疫應答，如產生抗該抗原的新抗體。
[0053] 本文所使用的術語"非肽基聚合物"是指生物相容性聚合物，其包括兩個或更多個 通過除肽鍵以外的共價鍵彼此相連的重復單元。
[0054] 可用于本發明的非肽基聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共 聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物 (如PLA(聚乳酸）和PLGA(聚乳酸-乙醇酸））、脂質聚合物、甲殼素、透明質酸及其組合， 并優選聚乙二醇。本領域中公知且在本領域技術范圍內易于制備的它們的衍生物也包括在 本發明的范圍內。
[0055] 用于通過常規的框內融合方法獲得的融合蛋白的肽接頭具有如下缺點：其在體內 容易被蛋白水解酶切割，因此不能如預期的獲得通過載體實現的充分增加活性藥物的血清 半衰期的作用。然而，在本發明中，可以使用對蛋白水解酶具有抗性的聚合物將肽的血清半 衰期維持在與載體相似的水平。因此，可以無限制地使用任意非肽基聚合物，只要它是具有 上述功能的聚合物即可，即對體內蛋白水解酶具有抗性的聚合物。非肽基聚合物具有1至 IOOkDa的分子量，優選1至20kDa的分子量。本發明的與免疫球蛋白Fc區連接的非肽基聚 合物可以是一種聚合物或不同類型聚合物的組合。
[0056] 本發明中使用的非肽基聚合物具有能夠與免疫球蛋白Fc區和蛋白質藥物結合的 反應性基團。
[0057] 非肽基聚合物在兩端都具有反應性基團，其優選選自：反應性醛基、丙醛基、丁醛 基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物。琥珀酰亞胺衍生物可以是琥珀酰亞胺丙酸酯、羥基 琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧甲基或琥珀酰基碳酸酯。特別地，當非肽基聚合物在其兩端 都具有反應性醛基時，則其在兩端與生理活性多肽和免疫球蛋白有效連接，且具有最小非 特異性反應。通過醛基成鍵的還原性烷基化產生的終產物比通過酰胺鍵成鍵的要穩定得 多。醛基反應性基團在低pH下選擇性地與N端結合，并在高pH(如pH 9.0)下與賴氨酸殘 基結合形成共價鍵。
[0058] 非肽基聚合物兩端的反應性基團可以是相同的或不同的。例如，非肽基聚合物可 以在一端具有馬來酰亞胺基團，而在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。因此，當在其兩端 具有反應性羥基的聚乙二醇用作非肽基聚合物時，可通過已知的化學反應將羥基活化為多 種反應性基團，或者可使用具有可商購經修飾反應性基團的聚乙二醇以制備本發明的蛋白 質綴合物。
[0059] 在本發明的另一方面中，本發明提供了包含本發明的胰島素綴合物的長效胰島素 制劑。
[0060] 本文所使用的術語"施用"意指通過特定的合適方法將預定量的物質引入患者中。 所述綴合物可以通過任意常規途徑施用，只要它能夠到達預期組織即可。考慮了多種施用 方式，包括腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、經口、局部、鼻內、肺內和直腸內，但本發明 并不局限于這些示例性施用方式。盡管如此，由于在經口施用時肽會被消化，所以經口施用 的組合物的活性成分應當被包被或配制為保護其在胃中免于降解。優選地，所述綴合物可 以可注射形式施用。此外，可以使用能將活性成分轉運入靶細胞的某些設備來施用所述長 效制劑。
[0061] 含有本發明綴合物的長效制劑可包含可藥用載體。就經口施用而言，可藥用載體 可包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、助懸劑、著色劑和芳香劑。 就注射劑而言，可藥用載體可包括緩沖劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩定劑。就用 于局部施用的制劑而言，可藥用載體可包括基底（base)、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。可以將 本發明的長效制劑與前述可藥用載體組合配制成多種劑型。例如，就經口施用而言，可以將 長效制劑配制成片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑