使用免疫球蛋白片段的胰島素綴合物的制作方法
【專利說明】
[0001 ] 本申請是申請號為201180022035. X的中國專利申請的分案申請，原申請是2011 年04月04日提交的PCT國際申請PCT/KR2011/002331于2012年10月31日進入中國國 家階段的申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及具有改善的體內持續時間和穩定性的胰島素綴合物、包含該胰島素綴 合物的長效制劑及其制備方法，該胰島素綴合物通過將胰島素與免疫球蛋白Fc區經非肽 基聚合物共價連接而制備。本發明提供了用于在有胰島素缺陷病癥（如糖尿病）的對象中 進行治療的方法。本發明的胰島素綴合物將肽的體內活性維持在相對高的水平，并顯著延 長了其血清半衰期，從而極大地提高了對胰島素治療的藥物依從性。
【背景技術】
[0003] 胰島素是由胰腺β細胞分泌的肽，它在控制機體的血糖水平中起著中心作用。當 機體中胰島素分泌不正常或者所分泌的胰島素不起作用時，血糖水平不被調節，從而發生 糖尿病。這種糖尿病被稱為II型糖尿病。當胰腺不產生足夠的胰島素從而使得血糖水平 增加時導致I型糖尿病。
[0004] 通常用化學合成的經口降血糖劑治療II型糖尿病，在一些情況下，用胰島素治療 患者。而I型糖尿病則需要胰島素治療。
[0005] 目前使用的胰島素治療方法是在飯前/飯后注射胰島素。但是，這樣的胰島素注 射應當每天3次地連續施用，其導致患者疼痛或不適。為了克服這一問題已進行了許多嘗 試。它們之一是通過提高肽類藥物的膜透過性從而經口或鼻吸入地遞送所述肽類藥物的方 法。并不理想地，與注射劑相比，該方法示出非常低的遞送效率，因此，維持所需水平的肽類 藥物體內活性仍然有許多困難。
[0006] 同時，有一種在皮下注射大量藥物后延遲藥物吸收的方法，從而使得通過每日僅 注射一次來維持血液水平。一些所開發的藥物（Ijantus 1% Sanofi-aventis)已得到 許可并且目前被用于患者。此外，已進行研究以延長作用時間，從而開發出地特胰島素 (Levemir) (Novo Nordisk)，其通過用脂肪酸修飾胰島素而制備，其中通過胰島素分子在注 射部位的自締合或者通過可逆結合血液中的白蛋白產生長效作用。但是，這些方法在注射 部位產生疼痛，并且每日注射也引起患者的極大不適。
[0007] 已進行了許多努力以提高肽類藥物的血清穩定性以及在延長的時間中將血液中 的藥物維持在高水平，從而使藥物的藥效最大化。肽類藥物的這些長效制劑需要提高肽類 藥物的穩定性并將效價維持在足夠高的水平，而不會引起患者的免疫應答。就制備肽類藥 物的長效制劑而言，按照常規使用具有高溶解度的聚合物（如聚乙二醇（PEG))來化學修飾 肽類藥物的表面。
[0008] PEG非特異性地結合靶標肽的特定位點或多個位點以起到增加肽的分子量的作 用，從而抑制通過腎的損失，并防止水解，而不引起任何副作用。例如，W02006/076471描述 了 B型利鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP)，其與NPR-A結合從而激活cGMP的產 生并引起動脈血壓降低，因此，BNP被用作充血性心力衰竭治療劑，它與PEG連接，從而保持 其生理活性。美國專利第6, 924, 264號描述了 PEG與艾塞那肽-4 (exendin-4)的賴氨酸殘 基結合從而增加了其體內駐留時間。這種方法增加了 PEG的分子量，從而增加了肽類藥物 的體內駐留時間。但是，隨著分子量的增加，肽類藥物的效價顯著降低，并且肽的反應性也 降低了。因此，其不理想地降低了產率。
[0009] WO 02/46227描述了使用基因重組技術通過將GLP-I、艾塞那肽-4或其類似物與 人血清白蛋白或免疫球蛋白片段（Fe)偶聯而制備的融合蛋白。美國專利第6, 756, 480號 描述了通過將甲狀旁腺激素（PTH)和其類似物與Fc區偶聯而制備的Fc融合蛋白。這些方 法可以解決如聚乙二醇化產量低和非特異性的問題，但是它們仍然具有這樣一個問題：增 加血液半衰期的作用不像預期的那么顯著，并且在一些情況下，效價也低。為了使增加血液 半衰期的作用最大化，使用了多種肽接頭，但是可能引起免疫應答。此外，如果使用具有二 硫鍵的肽（如BNP)，那么錯誤折疊的可能性高，而如果使用具有非天然氨基酸殘基的肽，那 么其可以通過基因重組產生，但難度很大。
【發明內容】
[0010] 技術問題
[0011] 鑒于此，進行了大量且深入的研究以開發能夠使胰島素的血清半衰期和體內活性 同時實現最大化的方法，結果發現免疫球蛋白Fc區、非肽基聚合物和胰島素通過共價鍵彼 此位點選擇性地相連接，從而與已知框內融合方法相比顯著增加了血清半衰期，得到了本 發明。
[0012] 解決方案
[0013] 本發明的一個目的是提供極佳的胰島素綴合物、包含該胰島素綴合物的長效制劑 及其制備方法，該胰島素綴合物維持胰島素的體內活性并顯著地延長其血清半衰期，。
[0014] 本發明的有利作用
[0015] 本發明的胰島素綴合物將肽的體內活性維持在相對高的水平，并顯著地延長了其 血清半衰期，從而極大地提高了有胰島素治療需要的患者的藥物依從性。
【附圖說明】
[0016] 圖1是胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物的藥代動力學分析的結果。
[0017] 圖2是對胰島素衍生物-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物的體內效力進行比較的結果。
[0018] 圖3是使用尺寸排阻柱分析胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物的β鏈的苯丙氨 酸處（B1F)90%或更高聚乙二醇化所得的結果。
[0019] 圖4a至4c是分析胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物的β鏈特異性結合所得的 結果。
【具體實施方式】
[0020] -方面，為了達到上述目的，本發明提供了一種胰島素綴合物，其通過將胰島素與 免疫球蛋白Fc區經非肽基聚合物連接而制備，其中所述非肽基聚合物與胰島素 β鏈的氨 基端相連接。
[0021] 在本發明中，胰島素是由胰腺應答于血液中升高的葡萄糖水平而分泌的肽，以吸 收肝、肌肉或脂肪組織中的葡萄糖并將其轉化為糖原，并阻止使用脂肪作為能量來源，從而 起控制血糖水平的作用。該肽包括其激動劑、前體、衍生物、片段和變體，優選天然的短效或 長效胰島素。
[0022] 天然胰島素是由胰腺分泌以促進葡萄糖吸收和抑制脂肪降解的激素，從而起 控制血糖水平的作用。胰島素是從不具有調節血糖水平之功能的前體（稱為胰島素原 (proinsulin))通過加工形成的。胰島素的氨基酸序列如下：
[0023] α 鏈
[0024] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-A sn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO. 1)
[0025] β 鏈
[0026] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-V al-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pr〇-Lys-Thr(SEQ ID NO. 2)
[0027] 胰島素激動劑意指與胰島素受體結合從而示出與胰島素相當的生物活性的化合 物，其與胰島素的結構無關。
[0028] 胰島素衍生物意指與天然胰島素具有至少80%的氨基酸序列同源性的肽，其可在 氨基酸殘基的一些基團上進行了化學替換（例如，α-甲基化、α-羥基化）、缺失（例如， 脫氨）或修飾（例如，N-甲基化），并且具有調節機體中血糖水平的功能。
[0029] 胰島素片段意指這樣的片段，其在天然胰島素的N端或C端添加或缺失一個或更 多個氨基酸，其中可以添加非天然氨基酸（例如，D型氨基酸），并且具有調節機體中血糖水 平的功能。
[0030] 胰島素變體意指具有與天然胰島素不同的一個或更多個氨基酸序列且具有調節 機體中血糖水平之功能的肽。
[0031] 胰島素的激動劑、衍生物、片段和變體的每種制備方法可以單獨使用或組合使用。 例如，本發明包括下述肽，即具有一個或更多個與天然肽不同的氨基酸并且N-端氨基酸殘 基脫氨，而且具有調節機體中的血糖水平之功能的肽。
[0032] 在一個特定實施方案中，本發明中使用的胰島素可以通過重組技術生成，還可使 用固相合成方法合成。
[0033] 此外，本發明中使用的胰島素的特征在于非肽基聚合物與胰島素 β鏈的氨基端 相連接。在本發明中，使用該非肽基聚合物作為接頭。胰島素 α鏈中的修飾引起活性和安 全性降低。因此，在本發明中，作為接頭的非肽基聚合物與胰島素的β鏈的氨基端相連接， 以保持胰島素活性和提高安全性。
[0034] 本文所使用的術語"活性"意指胰島素結合胰島素受體的能力，并意指胰島素通過 與胰島素受體相結合發揮其作用。
[0035] 可以通過pH控制（優選地控制在4. 5至L 5的范圍內）來完成非肽基聚合物與 胰島素 β鏈氨基端的這一結合。
[0036] 本文所使用的術語"Ν-端"可以與"Ν-端區域"互換使用。
[0037] 在一個具體實施例中，本發明人通過將PEG與免疫球蛋白Fc區的N-端連接并將 其選擇性地偶聯到胰島素 β鏈的N-端，從而制備了胰島素-PEG-免疫球蛋白Fe綴合物。 本發明中制備的胰島素-PEG-免疫球蛋白Fe綴合物的血清半衰期顯著地增加到約18小 時，并且其在疾病動物模型中示出降血糖作用。因此，可以制備出維持胰島素體內活性的新 的長效胰島素制劑。
[0038] 免疫球蛋白Fe區用作藥物載體是安全的，因為它是體內代謝的可生物降解多肽， 此外，與整