8a-BontB轉化表達菌-大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導表達后， SDS-PAGE結果顯示：重組蛋白PET-28a-BontB在50KD左右處有一明顯表達帶，大小與理論 值相符；見圖5 ; 將重組蛋白表達菌裂解液上清和沉淀同時做SDS-PAGE電泳，其中上清與沉淀的比例 為1:10,結果顯示，目的蛋白絕大多數在上清中，沉淀中相應位置也存在少量目的蛋白，認 為通過誘導條件的優化，在適宜的誘導環境下能夠以可溶形式表達，見圖5。
[0038] 實施例4:重組蛋白PET-28a_BontB的純化 重組蛋白的初步純化：大量制備細菌，誘導表達重組蛋白，可溶性蛋白先進行DEAE陰 離子交換層析柱，并收集流川峰，再進行屬螯合層析Cu2+柱，收集200mM咪唑洗脫的目的蛋 白。
[0039] 用 Thrombin 酶切除 His-Tag 重組蛋白的二次純化：酶切后的蛋白進行屬螯合層析Cu2+柱，收集250mM咪唑洗脫的 目的蛋白。收集的蛋白經SDS-PAGE結果分析，如圖，可在50KD左右處有一明顯條帶，且純 化效率可達90%以上，見圖5。
[0040] 實施例5:全人源抗Bont-B-scFv抗體的篩選 純化的重組蛋白為抗原包被于96孔酶標板上，4°C過夜。次日棄上清，用2%的Mi Ik-PBS 3 7 °C封閉2 h，加入噬菌體抗體庫，滴度為1. 0 X 1013，室溫下劇烈晃動孵育6 0 m i η，靜置 60min。后棄去液體，用含0. l%Twenn-20的PBS洗滌10次，洗滌后將每孔中殘留的液體輕 輕拍干，每孔加入5〇μL洗脫液（5mg/mL的胰酶-PBS)，室溫下劇烈晃動lOmin，洗脫噬菌體， 收集4 °C保存。
[0041] 用洗脫下的噬菌體侵染E. coli TG1，并涂布于TYE平板上(含lOOPg/mLAmp和1% 的葡萄糖）37°C過夜培養。利用輔助噬菌體KM13擴增噬菌體庫，通過PEG/NaCl回收噬菌 體。重復以上過程3次，共4輪篩選，收集篩選的噬菌體庫。
[0042] 實施例6:Bomt-B活性檢測底物一GFP-SV的基因構建與純化 根據GenBank 中登錄的SNAPE25、VAMP基因序列，設計并合成 HIS6-SNAPE62-EcoRI-VAMP57C-TAA基因，同時在基因兩端分別插入BamHI和Hind III酶切位 點，合成重組質粒PMD19-T- SV。
[0043] 根據綠色熒光蛋白GFP基因，設計一對特異性引物， 上游引物 Pl: 5' -CATGccATGGTGAGCAAGGGCG-3' 下游引物 P2: 5' -GCGGATCCcttgtacagCTCGTCCATG-3' 以Pl和P2為引物，GFP質粒為模板，PCR擴增GFP基因，利用內切酶NcoI、BamHI雙酶 切載體pET-28a和720bp PCR回收產物，，以T4DNA連接酶連接pET-28a和GFP基因片段， 連接產物轉化感受態E. coli JM109,次日挑取單菌落，提取質粒。對其進行PCR、雙酶切 以及測序鑒定，得出GFP成功克隆到pET-28a中，并未發生堿基丟失和突變，成功構建載體 pET-28a-GFP。
[0044] 用內切酶Hind III和BamHI對合成的重組質粒pMD19-T-SV和重組表達質粒 pET-28a-GFP雙酶切，分別回收393bp小片段和pET-28a-GFP載體大片段，以T4DNA連接酶 連接。連接產物（pET-28a-GFP-SV)轉化感受態E.coliJM109，涂布Kan(50μg/ml)的LB 平板上，37°C培養過夜。次日挑取單菌落，提取質粒，經雙酶切和測序鑒定后，得出SV基因 成功插入到pET-28a-GFP載體中，成功構建pET-28a-GFP-SV表達載體。
[0045] 將重組質粒pET-28a-GFP-SV轉化表達菌-大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導表達， 確定了最佳的表達方式：LB培養基，37°C，3 h。超聲破碎菌體后經SDS-PAGE電泳檢測，確 定目的蛋白絕大多數在上清中，故目的蛋白以可溶形式表達。
[0046] 重組蛋白GFP-SV的純化，重組蛋白表達菌體經超聲裂解，先后經過DEAE陰離子交 換層析，金屬螯合層析，Q陽離子交換層析，獲得純度在90%以上的純品GFP-SV。熱原質檢 測<20EU/mg，滿足蛋白性質研宄的需要。
[0047] 實施例7:抗Bont-B-scFv陽性菌株鑒定 篩選后的噬菌體侵染凡HB2151，誘導表達后，利用ELISA鑒定，置酶標儀測定OD 值(波長為490nm)，每個樣品做雙孔測定，取OD平均值。以2%MiIk-PBS為陰性對照，陽性克 隆菌株確定標準為：OD值為陰性對照的3倍以上，共獲得200株陽性克隆菌株。
[0048] 陽性菌株生物活性檢測，將GFP-SV用包被液稀釋，每孔包被3(^g于檢測板 (Pierce Maleimide Activated 96-well Plates, Black, 15153)中，4 °C 過夜，用 Wash buffer洗滌3次，將200株陽性菌株，誘導表達離心后，將100μL上清和4 Pg Bont-B混勻， 加入到檢測板中，37°C作用2h，每份樣品做雙孔測定，再用Wash buffer洗滌3次，在多功能 酶標儀上檢測熒光強度，得出3株活性較好的菌株。按照Tomlinson I+J試劑盒上的pIT-2 載體的基因序列，合成兩條特異性PCR引物擴增scFv全基因片段。
[0049] Pl LMB3: 5' 一CAG GAA ACA GCT ATG AC-3， P2 pHEN: 5' 一CTA TGC GGC CCC ATT CA-3' 經檢測3株陽性菌株，均能夠出現明顯900bp條帶，含有完整的scFv。
[0050] 測序鑒定其序列并經Blast數據庫分析得出：得出3株陽性菌株均為人源單鏈抗 體，分析如下： 3A-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC IMKYL LPTA AAGL LLLAA CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA Q PAMA E V QLL ES GGG L V CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT QPGGSLRLS CAA SG FTF CDR-Hl AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG S SYAMSff V R QA PG KG LE CDR-H2 TGG GTC TCA AAT ATT TCT TCT AAT GGT AAT GCT ACA GCT TAC GCA GAC TCC GTG W V SN I S S N G N A T AY ADSV AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG KGR FT I SRN NSKN T L YL CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA QMNS L RA ED TA VYY CAK CDR-H3 TAT ACT TAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG YTYA FD Y ff G QGT LVTVS Linker AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG S GG GGSGG GG SGG GG S T GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC D IQ MTQ SP S SL SA SVGD AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT CDR-Ll RVTIT CRASQS I SSYLN TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TAT GCA W_ Y Q QK PGK A P KL L I YYA CDR-L2 TCC AAT TTG CAA AGC GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG SNLQS GVPSRFSGSGSG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TDFT LT IS S LQPED FATY CDR-L3 TAC TGT CAA CAG GAT TCT TAT ACT CCT TCT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG Y CQQD SYT PST F G QGT K GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA VEI KR AA AH HHHHHG A A GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG EQKLIS EE DLNGAA 2F-scFv ： ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG I MK YLL P TA A AGL LLL A GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG A QPA MA EVQ LL ES GGGL CDR-Hl GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TC