抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-scFv及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物技術領域，具體涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體 2F-scFv，及其在生產治療B型肉毒毒素酶中毒藥物方面、檢測B型肉毒毒素酶方面的應用， 還涉及篩選抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F- SCFv的底物。
【背景技術】
[0002] 肉毒毒素可導致人及動物肉毒中毒，其感染劑量極低，從靈長類動物實驗中得出， 最低致死劑量（LD50)為lng/kg，因此，它已被美國疾病控制和預防中心指定為對人類的威 脅類似于炭疽的生物武器。導致肉毒中毒的原因大致分為四個類型，一、成人肉毒中毒。二、 嬰兒感染性肉毒中毒。三、傷口感染性肉毒中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然狀態下或者是在培養基中形成，通過細菌裂解釋放到 環境或培養液中，這種形態的毒素被稱為前體毒素，其分子量范圍在300 kDa到900 kDa。 前體毒素通常以復合體的形式存在，由神經毒素（Bont)，由一個或多個能夠包圍和保護毒 素的非毒性蛋白組成，包括血凝素（HA)，非毒素非血凝素（NTNH)。臨床上所說的肉毒毒素 通常指具有神經毒性作用的神經毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根據其抗原性的不同，共存在七種血清型（A、B、C、D、E、F、G、），盡管七種 血清型的肉毒毒素組成成分與它的作用機制略有差別，但是它們有著相近的分子量和相似 結構。成熟肉毒毒素均由約150 kDa的單鏈多肽組成，蛋白質成熟時通過細菌介導的蛋白 酶將150kDa的單鏈多肽切割裂解成兩個不相等的多肽片段，兩個片段由一個二硫鍵連接， 形成一個分子量為50kDa的輕鏈片段（LC)和一個分子量為IOOkDa的重鏈片段（HC)。其中 輕鏈有一個催化功能域，重鏈包含分子量均為50kDa的兩個功能域，N端部分為跨膜域，C 端部分為神經節苷脂結合域。單獨的輕鏈和重鏈均無毒性，只有雙鏈才具有生物學毒性。
[0005] 輕鏈由細胞內毒素蛋白組成，具有鋅離子依賴內切酶活性，可抑制神經遞質的釋 放。肉毒毒素的活性區埋藏（~20 A深)于輕鏈中，表面負電荷，可通過一個通道獲得。梭狀 神經毒素的活性位點包括一個單一的鋅原子，這個鋅原子歷來被認為有功能，但是不起結 構性作用。可以通過用金屬螯合劑去除鋅，但是通過在二級結構上加入游離的鋅原子來重 新獲得鋅，毒素與底物結合的能力幾乎不變，但輕鏈的生物學活性卻大大的降低了，只相當 于原來的30%。位于輕鏈中心有一個高度保守的鋅結合模塊HExxH (X是任意的氨基酸)序 列。HExxH序列中含有一個由3個組氨酸整合的鋅離子，并對突觸泡膜蛋白質具有特異性 蛋白水解活性，這個催化位點位于蛋白質表面較深的裂縫中。
[0006] 在人類肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占據最重要的地位，其中A型肉 毒毒素輕鏈上的His 222，Glu223和His226殘基共同組成了鋅結合模塊HExxH序列的一 部分，并且在協調活性區鋅（His 222和His226)和一個水分子（Glu223殘基）的作用機制 中起了直接的作用。Glu261是協調鋅的第三配體。甚至有人認為A型肉毒毒素的催化機 理與嗜熱菌蛋白酶是相似的，這是因為基于結構和序列相似的基礎上，他們的活性位點也 是相似的。從Glu223到Asp的突變使得活性幾乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素 失去了催化活性。通過對肉毒毒素結構分析表明，A、B型肉毒毒素中與作用機制相關的關 鍵氨基酸殘基是相同的。與突觸泡蛋白結合的B型肉毒毒素的晶體結構表明，Arg369和 Tyr372殘基位于接近被毒素裂解的肽鍵。肉毒毒素中中和殘基的突變使催化速度常數明顯 降低，但是不影響鋅結合和底物結合，人們提出，這些殘基在過渡態穩定中發揮了作用。
[0007] 另外，在LC活性中心還有一些氨基酸殘基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。 它們的功能主要是維持和穩定輕鏈活性中心的結構和/或它與被結合底物的相對位置，以 此保證輕鏈最佳的酶解能力。
[0008] LC通過二硫鍵與HC的N端連接。在二硫鍵存在的狀態下，毒素重鏈HN結構域形 成一條loop結構，將深陷于輕鏈表面裂縫中的Zn 2+催化部位遮蔽住，從而不表現酶活性。在 雙鏈毒素進入神經細胞后，二硫鍵被還原，釋放出的輕鏈才能表現鋅離子內肽酶活性，催化 部位能夠容納底物16個氨基酸殘基。催化部位的鋅離子除同4個組氨酸殘基的咪唑環、1 個結合于保守谷氨酸的水分子形成配位鍵外，還與另一分子的谷氨酸羧基形成配位鍵，1個 色氨酸分子很可能也參與鋅離子的配位。毒素輕鏈的這種獨特鋅離子配位形式、空間結構 與其他所有已知的金屬蛋白酶的三維結構都不同，應當屬于一個新型的金屬蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病機理 1、靶細胞的識別與結合 前體毒素進入胃腸道，在消化過程中，非毒素組分對神經毒素起到保護作用，使其不會 受到各種消化酶和胃酸的侵蝕。由于分子量過大，毒素分子不是以擴散的方式，而是以"內 凹"和細胞攝入的方式通過腸粘膜上皮屏障，而不會破壞胃腸道。然后進入小腸中，在小腸 的微堿性環境下，前提毒素中的神經毒素解離出來，進入血液及淋巴循環，在運動神經和交 感神經處發揮其毒性作用。盡管神經毒素可侵入不同的組織和器官，但不能穿透血腦屏 障，其惟一的親和靶點是外周膽堿能神經末梢。在膽堿能神經末梢，毒素的輕鏈能夠抑制 神經遞質乙酰膽堿在神經肌肉接頭處的釋放，導致肌肉麻痹。在這一毒性作用過程中，神經 毒素的各功能域都有參與，具體的過程可分為三個階段。
[0010] 靶細胞的結合與內化 在靶細胞的識別與結合這一過程中，肉毒毒素重鏈的結合域發揮了作用。結合域能夠 識別膽堿能神經末梢，并與其發生特異性結合。結合域結合到運動神經元的神經節苷脂和 位于末端神經細胞膜表面小結上的蛋白受體，特別是具有親和力的GDlb，GTlb和GQlb類 神經節苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖組成的神經節苷脂連接到神經酰胺。通過對神經節 苷脂分布及對其親和結合力的研宄，可以確定，神經節苷脂不是唯一能促進肉毒毒素結合 的分子，而雙受體模型的提出表明，在發生內化作用前，肉毒毒素就已經結合到了蛋白受體 上。盡管有一些證據表明，突觸結合蛋白可能參與了 A、B和E型的內化作用，但是梭菌屬家 族每一個成員的受體，還沒有完全確定。每個毒素與其蛋白共受體都是特異性同源的，B型 肉毒毒素與唾液酸乳糖的混合物就與肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神經毒素與神經節苷 脂結合的一個〃鎖和鑰匙〃原理。這個觀察成功說明了一個觀點，那就是神經節苷脂結合 使肉毒毒素靠近蛋白受體，促進了毒素的識別和內化。
[0011] 一旦結合到神經元表面，母體分子裂解，重鏈和輕鏈通過鋅原子結合到達神經元 細胞膜，并且被內化進入細胞囊泡，形成一個包裹著毒素分子的酸性小囊泡。即內化過程。 這一受體介導的內吞過程與時間，溫度及突觸活動均有關。
[0012] 2、易位 肉毒毒素的輕鏈必須從囊泡小室或者胞內體中出來，并且在H鏈N-末端作用下的通過 膜運輸能夠成功進入細胞溶質的靶蛋白，這一過程是稱為輕鏈易位。
[0013] 與其它梭菌毒素一樣，肉毒毒素進入細胞內的酸性小泡后，會因 pH的變化而發生 結構重組。盡管進入突觸小泡和胞內小泡是顯而易見，但是肉毒毒素易位進入胞內小泡的 特性尚未斷然確定。PH的降低使肉毒毒素結構發生變化，從而導致其在分子中有較大的疏 水性，并且增加了脂雙層的滲透性。這樣毒素的重鏈和輕鏈能夠嵌入小泡的脂雙層內，一旦 嵌入，就會在磷脂雙層和PC12膜上形成離子通道。這個通道是具有選擇性的，分子量大的 分子無法通過，所以目前普遍認為毒素輕鏈可以通過離子通道從小泡腔內轉運到神經細胞 胞質。據此有三種輕鏈跨膜轉運假說模型，即管道模型（tunnel model)，裂縫模型（cleft model)和裂解模型（lysis model)。其中裂縫模型理論認為，在低pH時，蛋白質的分子構 想發生了改變，此時HC可形成一個親水性的裂隙，并且在輕鏈穿膜過程中將其親水表面包 圍。在此模式中形成了親水性和疏水性的相互作用。輕鏈的羧基端因為二硫鍵與重鏈氨基 端相連而最先進入到胞質。實現易位后，由于胞質的pH高于酸性小泡，使輕鏈結構重新折 疊，重新回到具有催化活性。
[0014] 在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域發生構象上的變化，最終跨越人工膜形成 離子通道，并且在體內PH的環境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成 的離子通道與白喉毒素形成的相似，并且也是只在低PH下形成。肉毒毒素離子通道只允許 陽離子通過，但是可以在體外阻止氯喹。然而對于小孔徑離子通道的研宄，我們尚未清楚肉 毒毒素形成的通道是不是毒素輕鏈進入細胞溶質的必經之路。數據顯示，在低PH下輕鏈的 結構有一個戲劇性的變化，就是可能產生一個選擇性的LC結構并且更適合于易位。盡管這 在體內還沒被證實，但是通過低PH誘導結構變化是完全可逆的。
[0015] 肉毒毒素能夠在神經傳遞發揮作用，就必須通過蛋白水解使LC與HN接頭處暴露 的表面產生缺口，從而使非活性的單鏈分子量為150-kDa的毒素活化。少數的細菌和組織 蛋白酶能夠實現這個裂解反應，并產生有活性的雙鏈神經毒素。產生切口后，輕鏈和重鏈仍 然通過非共價鍵相互作用，并且由一個單一的二硫鍵連接。這種鏈間的二硫鍵（A型肉毒毒 素中的Cys430 - Cys454)的減少是輕鏈活化的第二階段，這是輕鏈自由進入運動神經元胞 質溶膠和與底物間相互作用必不可少的階段。正如前面提到的，在低PH情況下，輕鏈有一 個戲劇性的變化。這種結構的變化有助于易位帶(如果在易位點HN域確實是靠近輕鏈）的 重組和導致輕鏈的最終活化。神經元信號轉導通路可以與肉毒毒素-LC活動密切聯系在一 起的。因此，輕鏈活化的完成最終可能是發生在胞質溶膠中的，緊接著從低PH的小室中易 位。
[0016] 3、抑制神經遞質釋放 神經小結處有突觸小囊泡，其中包含乙酰膽堿，它是能穿過神經肌肉接頭刺激肌肉收 縮的一種神經遞質。該乙酰膽堿的小囊泡被一個叫做SNARE復合體的蛋白聚合物所結合。 為了穿過神經肌肉交界處實現信號的傳遞，突觸前神經小結中的乙酰膽堿小囊泡必須被釋 放到突觸間隙中。在這里，神經遞質在肌肉板上結合到特定受體上，觸發離子通道打開，從 而導致相鄰橫紋肌的去極化和收縮。乙酰膽堿的釋放，需要有SNA