RE蛋白的參與，它能夠介 導突觸小泡與神經元細胞膜的融合。
[0017] SNARE復合體蛋白參與突觸小泡上質膜融合，而肉毒毒素輕鏈的作用是阻礙胞吐 作用。更具體地說，就是在肌肉接頭處，神經毒素通過切割SNARE蛋白（乙酰膽堿分子胞吐 作用所必須的物質）阻斷了囊泡內容物釋放到細胞外環境中，抑制乙酰膽堿的釋放，從而抑 制神經傳遞。據證實，單獨的SNARE蛋白裂解不會妨礙SNARE復合體形成，但是卻會導致非 功能性復合物在Ca 2+內流和融合之間的耦合被破壞。毒素在抑制神經遞質釋放時，需要Ca2+ 的參與，而在突觸末梢Ca 2+濃度增加會影響肉毒毒素的作用效果。
[0018] 輕鏈作為鋅肽鏈內切酶蛋白切割致使SNARE復合物不穩定，成為非功能性，從而 抑制乙酰膽堿釋放到突觸間隙。囊泡釋放到突觸間隙的數量越少，動作電位傳播的概率就 越低，從而引起肌肉纖維的收縮。結果導致肌肉自身的化學去神經術而引起弛緩性麻痹。現 有研宄表明SNARE復合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三種蛋白質組成，下表所示為不同 類型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位點。
[0019] 噬菌體展示技術的基本原理是把外源DNA插入噬菌體編碼外殼蛋白pin或 PVIiI的基因中，使外源DNA片斷對應的表達產物融合在噬菌體的外殼蛋白中形成融合蛋 白（fusion protein)，呈現在噬菌體表面。噬菌體展示技術的顯著優點是：建立了基因型 (genotype)和表型（phenotype)之間直接的物理聯系，從而使篩選簡便高效。將外源蛋 白或多肽表達于噬菌體表面，就可根據其性質利用它與其他生物或非生物物質的親和性對 含目的基因的菌體進行篩選。以菌體抗體庫的篩選為例，將Fab (fragment antigen binding)表達在菌體表面，以相應的抗原為親和性配體篩選，可以快速高效地從大量克 隆中篩選表達特異性抗體的噬菌體。因此，用噬菌體展示技術制備高親和性抗體與傳統的 雜交瘤單克隆抗體技術相比具有明顯的優勢。
[0020] 噬菌體抗體在膜表面表達，是通過Fab段或ScFv與單鏈噬菌體外殼蛋白形成融 合蛋白而完成。其特點是"它既可識別相應的抗原并與其結合，又能夠感染宿主菌進行再 擴增"。利用其可再擴增的特性，以靶抗原通過親和吸附-洗脫-擴增，可篩選到靶分子的配 體肽鏈。再經突變和鏈置換方法改進抗體親和力，最終便獲得高親和力的特異性抗體。噬 菌體抗體庫的篩選包括兩個主要步驟：淘篩和鑒定。淘篩是將噬菌體抗體庫與選擇用的抗 原共同孵育，通過幾輪洗脫，收集結合的噬菌體。將獲得的噬菌體感染細菌并擴增，再進行 下一輪的淘篩。經幾輪淘篩后，便可富集到與抗原特異性結合的噬菌體感染的多克隆菌株。 鑒定過程是從噬菌體感染的多克隆菌株中挑選出單克隆菌株。即將淘篩出的噬菌體感染細 菌、鋪板、挑選，即可得到高特異性單克隆菌株。
[0021] 從噬菌體抗體庫中篩選表達特異性抗體的噬菌體的經典方法主要有兩種：（1)將 純抗原包被在固相介質上，如酶標板、免疫試管或親和層析柱，然后加入待篩選的噬菌體， 洗去非親和性或低親和性的噬菌體，回收高親和性的噬菌體。（2)將抗原與生物素基團相 連，再將其固定在包被有streptavidin的順磁珠上對菌體進行篩選。兩種方法中均需加 脫脂牛奶（或BSA，其效果較差）封閉未被抗原占據的位點，以避免噬菌體非特異性的結合。 對于前一方法，回收與抗原特異性結合的噬菌體可用堿性溶液（如三乙基胺，（triethy- Iamine)或酸性溶液（如甘氨酸一鹽酸，glycine_HCl)洗脫，或用可溶的抗原或半抗原洗 脫；對于后一方法，用二巰基蘇糖醇（dithiothretOl，DTT)通過破壞抗原與生物素之間的 二硫鍵來洗脫。回收的噬菌體感染宿主菌，增殖后進行下一輪篩選。一般經過3-5輪這樣 的篩選可得到表達高親和性的目的抗體的克隆。每一輪篩選都需要進行檢測，以證實篩選 的有效性。
[0022] 英國 MRC HGMP 資源中心創建的 Human Single Fold scFv Libraries I+J ( Tomlinson I + J)是當今成熟的全人源噬菌體抗體庫，其庫容超過IO8全人源噬菌體單鏈 抗體，本研宄利用該噬菌體庫淘選特異性抗B型肉毒毒素單鏈抗體，并對陽性單鏈抗體進 行系統分析，以期創制B型肉毒毒素中毒治療抗體類藥物奠定物質基礎。
[0023] 本發明人通過對肉毒毒素的作用機理的了解及研宄，確定肉毒毒素能夠引起人畜 共患病，且主要攻擊體內的神經突觸系統，其致病機理為，肉毒毒素通過其重鏈C端結構域 結合于膽堿能神經元的突觸前膜，形成毒素受體復合物內化進入細胞囊泡，然后輕鏈鋅內 肽酶酶活性區從細胞內的酸性空間釋放進入細胞質。一旦從囊泡中釋放出來，輕鏈通過切 害J SNARE復合物蛋白來阻止乙酰膽堿的釋放，引起肌肉麻痹。因此輕鏈為主要的致病部位。 目前，國內外關于A型肉毒毒素的報道已相對比較全面，但關于B型肉毒毒素的研宄報道相 對較少，同時缺乏B型肉毒毒素治療方法和藥物，這樣就造成了一旦有人罹患B型肉毒中 毒，將無法及時進行正確治療的境況。抗體是治療肉毒中毒最有效的方法，但目前研宄或有 限使用的異源性血清抗體存在著許多缺點，如引起免疫反應或傳染疾病等，導致無法推廣 應用。由于此類抗體分子量較大，難于穿透細胞膜，針對已經進入細胞的毒素輕鏈則無治療 效果，因此本發明旨在克隆表達B型肉毒毒素，通過重組蛋白在人源化抗體庫中篩選中和 性人源化單鏈抗體，為研制抗B型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測B型肉毒毒素奠定基 礎。
【發明內容】
[0024] 本發明的目的是為解決異源性血清抗體在治療B型肉毒毒素中毒，存在引起免疫 反應或傳染疾病的問題，而提供一種全人源的單鏈抗體ScFv，抗B型肉毒毒素酶活性的人 源單鏈抗體2F-scFv。
[0025] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-scFV，其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。
[0026] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-SCFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 8所示。
[0027] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-SCFv在生產治療B型肉毒毒素酶中毒 藥物方面的應用。
[0028] 抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F_scFv在檢測B型肉毒毒素方面的應 用。
[0029] 本發明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-scFV，它是利用 人工合成的重組蛋白BontB，及篩選抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體的底物 GFP-HIS6-SNAP25 (62)-VAMP (57)-C，人源化抗B型肉毒毒素酶活性抗體庫中篩選出來的， 親和常數為（5. 35±0. 903) X 105L/mol，為生產抗B型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測 B型肉毒毒素奠定了基礎。
【附圖說明】
[0030] 圖1為雙酶切pMD-IOT-Bont-B質粒電泳結果；I. EcoR I和Nde I雙酶切質粒 pMD-19T-Bont-B ； 2. DNA marker DL2000〇
[0031] 圖 2 為 PCR 鑒定重組質粒 PET-28a-BontB 結果圖；I. DNA marker DL2000 ; 2. 3. 4.均為BontB區域PCR擴增產物。
[0032] 圖3為雙酶切重組質粒PET-28a-BontB鑒定結果；其中：1· 2.均為EcoR I和 Nde I 雙酶切質粒 PET-28a-BontB 3. DNA marker DL2000 ; 圖4為重組蛋白表達形式鑒定其中：1.未誘導菌超聲沉淀；2.誘導菌超聲沉淀；3.未 誘導菌超聲上清；4.誘導菌超聲上清國5:誘導的全菌體；6.蛋白質Marker ; 圖5為重組蛋白SDS-PAGE結果分析；其中：1.蛋白質marker ;2.初步純化的目的蛋 白；3.最終純化的目的蛋白； 圖6重組質粒PET-28a -GFP的雙酶切鑒定（NcoI和BamHI);其中1:質粒PET_28a -GFP 的雙酶切產物；M : DNA marker DL2000 ; 圖 7 質粒 PET-28a-GFP-SV 的雙酶切產物；M :DNA marker DL5000 ; 圖8純化后2F-scFv SDS-PAGE結果分析；I:流穿2:55%硫酸銨原樣3:純化后scFv。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1:B型肉毒毒素輕鏈基因的合成 根據Genbank報道的B型肉毒毒素全基因序列，設計并合成輕鏈基因，同時插入EcoRI 和恥6 1酶切位點，將基因片段克隆入？1?-191'仰(^〇1'，轉化入舅109中。
[0034] 實施例2:B型肉毒毒素輕鏈基因與PET_28a載體連接 利用內切酶EcoR 1和Nde I雙酶切質粒pMD-19T-Bont-B，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳 分析，結果見圖2所示，可見到大小約為1335的目的基因 BontB，與預期的大小相符； 將EcoRI和Nde I雙酶切的載體PET-28a大片段與目的基因 BontB小片段回收，并用T4 DNA連接酶連接，得到重組質粒PET-28a-BontB，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，含kan抗 性的瓊脂糖平板進行初步篩選。挑選單菌落于LB液體培養基中培養；用質粒回收試劑盒提 取質粒。
[0035] 通過合成插入EcoRI和Nde I酶切位點的B型肉毒毒素輕鏈基因序列，為其設計引 物，上游引物標為Pl，下游引物標為P2。
[0036] Pl (23bp) :5' CATATgCCAgTTACAATAAATAA-3' P2 (23bp) :5' gAATTCTCATTTAACACTTTTAC-3' 以重組質粒PET-28a-BontB為模板，Pl和P2為引物進行擴增反應，得到的PCR產物， 經瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，（見圖3); 用限制性內切酶和EcoR I和Nde I進行雙酶切鑒定，并進行序列的測定。可見質粒經 雙酶切后，PCR擴增目的條帶后，在1335bp上均有目的基因帶(見圖4)，證明目的基因 BontB 基因已經連接到載體上，成功的構建了重組質粒PET-28a-BontB。
[0037] 實施例3:重組蛋白PET-28a-BontB表達產物的SDS-PAGE結果分析 將重組質粒PET-2