[0142] 以大豆屬大豆（Glycine max L.)鐵豐8號植株cDNA為模板，用GmNF-YA2-121F和 GmNF-YA2-121R進行PCR擴增，得到大小約915bp的PCR產物（GmNF-YA2基因）。
[0143] 回收上述PCR產物。
[0144] 2)、重組載體的構建
[0145] ①用限制性內切酶Sma I和SacI酶切步驟1回收的PCR產物，回收931bp酶切產 物；
[0146] ②用限制性內切酶sma I和SacI酶切pBI121(Clontech公司購買)，回收HOOObp 載體骨架；
[0147] ③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接；
[0148] ④將步驟③的連接產物電擊轉化TOPlO菌株(購自北京天根公司)，37°C過夜培養， 挑取陽性克隆提取質粒進行測序。
[0149] 測序結果表明，質粒為將序列表的序列2所示的DNA片段插入載體pBI121的 Sma I和SacI酶切位點之間得到的重組載體，命名為pBI121-GmNF-YA2。
[0150] 3、重組農桿菌的獲得
[0151] 用重組質粒pBI121-GmNF-YA2基因轉化農桿菌C58C1 (北京拜爾迪生物技術公司 購買)，得到重組農桿菌C58Cl/pBI121-GmNF-YA2(提取質粒送去測序，為pBI121-GmNF-YA2， 則含有該質粒的重組菌為陽性)。
[0152] 4、轉GmNF_YA2擬南芥獲得
[0153] 1)將3得到的重組農桿菌接種于LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉 素，50mg/ml慶大霉素）液體培養基中，28°C、3000rpm培養約30小時，得到菌液；
[0154] 2)將菌液轉至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素 ，50mg/ml慶大霉素） 中，28°C、300rpm培養約14小時(菌液0D600達到1.5-3. 0);
[0155] 3)收集菌體，4 °C、4000g離心10min，用含10%蔗糖MS液體培養基(含 0· 02%silwet)稀釋至 0D600 約為 0· 8-1. 0 ;
[0156] 4)將擬南芥(哥倫比亞生態型Col-0, SALK公司購買，也稱為野生型擬南芥）整株 與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆， 側放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料布，直立放置花盆，進行正常的光照培養， 收獲T 1代種子，卡那霉素篩選(濃度為50 μ g/L卡那霉素)陽性植株為T1代再生植株，傳代， 直到得到T3代再生植株。
[0157] T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T 2代自交產生的 種子及由它所長成的植株。
[0158] 提取T3代再生植株完整植株的RNA，反轉錄得到cDNA作為模板，用引物對： F: 5' -ATGCCGGGGAAAGCTGA-3' ；R: 5' -TCATTTGAAAGCCCCATTATTA-3' ；進行 PCR 擴增。
[0159] 部分樣本的結果見圖3, M為Marker, col-0為哥倫比亞生態型野生型擬南芥， L1-L8為T3代再生植株。
[0160] LI、L3-L8得到大小為915bp片段的為陽性，即為T3代轉GmNF-YA2擬南芥。
[0161] 采用同樣的方法將質粒PBI121轉入野生型擬南芥中，得到轉空載體擬南芥，培育 獲得T 3代轉空載體擬南芥，采用同樣的方法鑒定，未得到915bp片段。
[0162] 二、轉基因植物的耐旱性鑒定
[0163] 1、干旱脅迫對萌發率影響
[0164] 將 T3 代轉 GmNF-YA2 擬南芥的 3 個株系 GmNF-YA2-l (L3)、GmNF-YA2-2 (L4)、 GmNF-YA2-3 (L5)、T3代轉空載體擬南芥和野生型擬南芥各25粒種子經消毒處理后，用牙簽 單粒均勻分別點在MS培養基（MSO)和含有4% (質量百分含量）PEG的MS培養基
[0165] (4%PEG+MS0)上，用封口膜密封，放4°C放置3天后，移入23 °C，12h光照/8h黑暗， 60%相對濕度的培養室中培7d后統計萌發率，子葉完全開并為綠色的幼苗計為萌發，每個 處理設三個重復，結果取平均值。
[0166] 結果如圖4所示，圖4A和4E為野生型擬南芥Col-O，圖4B和4F為T3代轉GmNF-YA2 擬南芥的株系GmNF-YA2-3、圖4C和4G為T 3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-4、圖 4D和4H為T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-5,可以看出，在不含PEG的MS培養 基上，野生型擬南芥和T3代轉GmNF-YA2擬南芥萌芽無顯著差異；而在PEG脅迫下，T 3代轉 GmNF-YA2擬南芥萌芽多余野生型擬南芥。
[0167] 統計萌芽率，野生型擬南芥Col-O種子的萌發率為64%，
[0168] T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-3種子的萌發率為84% ;
[0169] T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-4種子的萌發率為92% ;
[0170] T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-5種子的萌發率為96% ;
[0171] 干旱脅迫處理后，轉基因植物種子萌發率高于野生型，T3代轉空載體擬南芥和野 生型擬南芥結果無顯著差異。
[0172] 2、干旱脅迫對幼苗生長影響
[0173] T3 代轉 GmNF-YA2 擬南芥的 3 個株系（GmNF-YA2-3、GmNF-YA2-4 和 GmNF-YA2-5)、 T3代轉空載體擬南芥和野生型擬南芥種子經消毒處理后，種植在MS培養基上，用封口膜密 封，放4°C放置3天后，移入23°C，12h光照/8h黑暗，60%相對濕度的培養室中培養5d后，用 鑷子分別移栽到MS培養基（MSO)和含有4% (質量百分含量)PEG的MS培養基（4%PEG+MS0) 上，每個處理設三個重復，結果取平均值。
[0174] 結果如圖5所示，可以看出，在MS培養基上T3代轉GmNF-YA2擬南芥的3個株系 和野生型擬南芥的生長狀況沒有顯著差異；
[0175] 在含有4%PEG的MS培養基上T3代轉GmNF-YA2擬南芥的三個株系的生長狀況均 優于野生型擬南芥Col-Ο,具體體現在轉基因植株主根長大于野生型。
[0176] 統計如下：MS培養基（MSO)中培養，野生型擬南芥Col-0、T3代轉GmNF-YA2擬南 芥的株系GmNF-YA2-3、T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-4、T3代轉GmNF-YA2擬南 芥的株系 GmNF-YA2_5 的主根長度分別為 4. 81cm、4. 65cm、4. 78cm、4. 73cm ;
[0177] 在PEG脅迫下野生型擬南芥Col-0、T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-3、 T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-4、T3代轉GmNF-YA2擬南芥的株系GmNF-YA2-5 的主根長度分別為 2. 54cm、3. 18cm、3. 62cm、3. 51cm ;
[0178] T3代轉空載體擬南芥和野生型擬南芥結果無顯著差異。
[0179] 從上述實驗可以看出，基因 GmNF_YA2可以提高植物的耐旱性。
【主權項】
1. 一種蛋白質，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b) 將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。2.編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。3.根據權利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子為如下1) -3)中任一 種DNA分子： 1)編碼區為序列表中序列2所示的的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子； 3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。4.含有權利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 所述重組載體具體為將權利要求2或3所述DNA分子插入表達載體，得到表達權利要 求1所述蛋白質的載體。5.擴增權利要求2或3所述DNA分子或其任意片段的引物對。6.權利要求1所述的蛋白質、權利要求2或3所述的DNA分子或權利要求4所述的重 組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調節植物耐逆性中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述耐逆性為耐旱性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。8. -種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述DNA分子導入目的植物中，得 到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：權利要求2或3所述DNA分子通過權利 要求4所述重組載體導入所述目的植物； 所述耐逆性為耐旱性； 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。10. 權利要求1所述蛋白作為轉錄因子的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA2及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明的GmNF-YA2在干旱、高鹽和低溫的誘導下表達，編碼的蛋白定位到細胞核上，并且可以特異的調控含有CCAAT-box順式元件（核心序列：CCAAT）的基因的轉錄表達。本發明的GmNF-YA2可以提高植物的耐旱性和耐鹽性，為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種中發揮重要的作用。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/11
【公開號】CN104892742
【申請號】CN201410079150
【發明人】馬有志, 徐兆師, 江安龍, 鄭煒君, 陳明, 李連城
【申請人】中國農業科學院作物科學研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2014年3月5日