CCGCTCGAGTCATTTGAAAGCCCCATTATTA-3'
[0033] GmNF-YA2-121F :5,-TCC (XTOTATGCCGGGGAAAGCTGA-3，；
[0034] GmNF-YA2-121R :5' -C β?位77Γ TCATTTGAAAGCCCCATTATTA-3'。
[0035] 上述的蛋白質、上述的DNA分子或上述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組 菌在調節植物耐逆性中的應用也是本發明保護的范圍。
[0036] 上述應用中，所述調節植物耐逆性為提高植物耐逆性；
[0037] 上述應用中,所述耐逆性為耐旱性；
[0038] 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0039] 本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0040] 本發明提供的方法，是將上述DNA分子導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目 的植物的轉基因植物。
[0041] 上述方法中，上述DNA分子通過上述重組載體導入所述目的植物；
[0042] 所述耐逆性為耐旱性；
[0043] 所述耐旱性體現在如下1)或2):
[0044] 1)在PEG脅迫下，所述轉基因植物種子的萌發率高于所述目的植物；
[0045] 2)在PEG脅迫下，所述轉基因植物主根長度大于所述目的植物；
[0046] 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0047] 上述蛋白作為轉錄因子的應用也是本發明保護的范圍。
[0048] 本發明的實驗證明，本發明從大豆中克隆得到基因 GmNF_YA2，其在干旱、高鹽和低 溫的誘導下表達，編碼的蛋白定位到細胞質中，可以特異的調控含有CCAAT-box順式元件 (核心序列：CCAAT)的基因的轉錄表達，且本發明的GmNF-YA2可以提高植物的耐旱性，為人 為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物育種 中發揮重要的作用。
【附圖說明】
[0049] 圖1為GmNF-YA2與擬南芥氨基酸AtNF-YA9氨基酸序列的同源性比對結果
[0050] 圖2為GmNF-YA2受脅迫誘導表達的熒光實時定量（Real-time) PCR圖譜
[0051] 圖3為分子檢測在轉基因擬南芥中的目的基因
[0052] 圖4為野生型和轉基因擬南芥耐旱萌發率比較
[0053] 圖5為野生型和轉基因擬南芥耐旱性比較
【具體實施方式】
[0054] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0055] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0056] 下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗， 均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0057] 實施例1、基因 GmNF-YA2的獲得
[0058] 一、基因 GmNF-YA 15 的獲得
[0059] 將水培的生長10天左右的大豆鐵豐8號（國家種質資源庫，編號ZM242 ;記載在如 下文獻中：王彩潔，孫石，吳寶美，常汝鎮，韓天富.20世紀40年代以來中國大面積種植大 豆品種的系譜分析。中國油料作物學報。2013,35(3):246 - 252,公眾可從中國農業科學 院作物科學研究所獲得）四葉期幼苗干旱處理2小時，用液氮速凍，-80°C保存備用。采用 Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)進行 mRNA 的分離。第一鏈 cDNA 合 成用反轉錄酶XL (AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳 檢測。
[0060] 通過5' RACE和3' RACE的方法獲得大豆CCAAT-box的核轉錄因子C族基因全長 序列序列表中的序列2。
[0061] 該序列表中序列2所示的基因命名為GmNF-YA2,其開放閱讀框架為自序列表的序 列2的5'端第1位到915位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為GmNF-YA2,該蛋白的氨基酸 序列為序列表中的序列1，序列1由304個氨基酸殘基組成，具有保守的組蛋白折疊基序。
[0062] 上述序列2也可以通過人工合成。
[0063] GmNF-YA2的序列在Genabnk上進行比對，與擬南芥中的蛋白AtNF-YCl 1具有較高 同源性（圖1)，而在大豆中未發現同源蛋白，證明GmNF-YA2蛋白是一個新的蛋白。
[0064] 二、實時熒光定量PCR分析GmNF-YA2的表達特性
[0065] 1、脅迫處理
[0066] 苗齡為10天的鐵豐8號幼苗，進行以下處理：
[0067] (1)干旱處理（圖2A):將盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾 紙上，干旱培養30分鐘、1小時、2小時、5小時、12小時、24小時后取出材料，用液氮速 凍，-80°C保存備用。
[0068] (2)高鹽處理（圖2B):將大豆幼苗置于200mM的由NaCl溶液中，光照培養30分 鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時后分別取出材料，用液氮速凍，-80°C保存 備用。
[0069] (3)脫落酸處理（圖2C):將大豆幼苗置于100 μ M的脫落酸（ABA)溶液中，光照培 養30分鐘、1小時、2小時、5小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存備 用。
[0070] (4)高溫處理（圖2D):將大豆幼苗置于42°C下，光照培養30分鐘、1小時、2小時、 5小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存備用。
[0071] (5)低溫處理（圖2E):將大豆幼苗置于4°C培養箱，光照培養30分鐘、1小時、2小 時、5小時、12小時、24小時后取出并用液氮速凍，-80°C保存備用。
[0072] (6)氧化處理（圖2F):將大豆幼苗置于30mM的雙氧水（H202)溶液中，光照培養30 分鐘、1小時、2小時、5小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存備用。
[0073] (7)對照的處理：直接取未經任何處理的大豆幼苗_80°C凍存作為對照（0小時)。
[0074] 2、mRNA 的分離
[0075] 將上述各處理的大豆幼苗米用Quikprep Micro mRNA Purif ication Kit (Pharmacia)進行 mRNA 的分離。
[0076] 3、反轉錄為cDNA
[0077] 將純化的mRNA反轉錄為cDNA。
[0078] 4、實時熒光定量PCR
[0079] 將cDNA稀釋50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因的特異引物對（F: 5'-CCAATG ATAAGTCAGGTGAAGG-3 '，R: 5 ' -TGTTGCCCGTAAGTAGTCAA-3 '）對樣品進行 Q-RT-PCR 擴增，分析 基因對各種處理的應答情況，以 actin(F:5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3'，R:5'-GTCTTTCGC TTCAATAACCCTA-3'）做內參。Q-RT-PCR在ABT PRISM9 7000 實時熒光定量 PCR 儀上進行，一 次平行試驗設3次重復。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)報道的方法，即 算相對表達量。
[0080] A A C1T (Target Ct. Actin) Time x ^ ^T. Target ^T. Actin^ TimeO
[0081] Time x表示任意時間點，Time ^表示經actin校正后I倍量的目標基因表達。
[0082] 結果見圖2,可以看出GmNF_YA2對干旱，高鹽，脫落酸，高溫，低溫和氧化脅迫有不 同程度的響應。
[0083] 實施例2、GmNF_YA2作為轉錄因子中的應用
[0084] 用酵母單雜交系統證明轉錄因子的激活特性的主要原理如下：將CCAAT順式作用 元件和突變體CCAAT順式作用元件分別構建到pHISi-Ι載體和pLacZi載體的基本啟動子 Pmin(minimal promoter)上游，Pmin啟動子下游連接報道基因（His3、LacZ和URA3)。當連 接有編碼轉錄因子的目的基因的表達載體YEP-GAP (不含激活功能)分別轉化到連有CCAAT 順式作用元件和突變體CCAAT順式作用元件的酵母細胞后，如果連有突變體CCAAT順式作 用元件的酵母細胞中的報道基因不能表達，而連有特定的CCAAT順式作用元件的酵母細胞 中的報道基因能夠表達，說明該轉錄因子能與CCAAT順式作用元件結合，且具有激活功能， 激活了 Pmin啟動子，促使報道基因表達。從而證明了目的轉錄因子的體內結合特異性和激 活功能。
[0085] 表達載體YEP-GAP:中國農業科學院作物科學研究所保證向公眾提供；參考文 獻 Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcription factors, DREBland DREB2, with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Celll998Aug;10(8):1391-1406。
[0086] Yro液體培養基：細菌培養用酵母抽提物（BactO-Yeast Extract) 10g/L，細菌培 養用胰化蛋白胨（Bacto-Peptone) 20g/L，調節pH至5. 8,121°C /15min滅菌，降至60°C以 后加入40%的Glucose，使其終濃度為20g/L。
[0087] SD/HisYUraVTrp-選擇性培養基：不含氨基酸的酵母氮源（Yeast nitrogen base) 6.7g/L，營養缺陷型混合物（drop-out media without His/Ura/Trp)