植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA2及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA2及其編 碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫嚴重制約著大豆的生長、發育。因此，了解大豆對逆 境條件的應答與信號傳導機制，提高大豆品種的抗逆性，成為大豆遺傳研究及品種改良的 重要任務之一。
[0003] 在逆境脅迫下植物體內會產生一系列應答反應，伴隨著許多生理生化及發育上的 變化。明確植物對逆境的反應機制，將為抗逆基因工程研究和應用提供科學論據。目前，植 物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，探索用生 物技術來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應能力。
[0004] 在干旱、高鹽和低溫等環境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平 上做出相應的調整，以最大程度上減少環境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘 導表達，這些基因的產物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節其它相關基因 的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環境的抗性。與脅 迫相關的基因產物可以分為兩大類：第一類基因編碼的產物包括離子通道蛋白、水通道蛋 白、滲透調節因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等）合成酶等直接參與植物脅迫應答的基因產物； 第二類基因編碼的產物包括參與脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節的蛋白因子，如蛋白 激酶、轉錄因子等。其中，轉錄因子在植物脅迫應答的基因表達調控中起著重要作用。
[0005] 轉錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區域中順式作用元件發 生特異性作用的DNA結合蛋白，通過它們之間以及與其它相關蛋白之間的相互作用，激活 或抑制轉錄。轉錄因子的DNA結合區決定了它與順式作用元件結合的特異性，而轉錄調控 區決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等 作用的影響。
[0006] 目前已知在植物中與脅迫相關的轉錄因子主要有：具有AP2結構域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯應答兀件結合蛋白，ethylene responsive element binding protein)轉錄因子家族、含有堿性區域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 轉錄因子家族、結合CCAAT-box的主要核轉錄因子的CBF (CCAAT binding factor)類轉 錄因子、含有堿性螺旋-環-螺旋（bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇（Trp cluster)的MYB家族。這些轉錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應外，其它 四個家族均參與調節植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應。
[0007] NF-Y是一類結合順式作用元件CCAAT-box的轉錄因子，特異的識別并結合許 多真核生物組成型、誘導性和細胞周期依賴性基因的啟動子或增強子中的順式作用元件 CCAAT-box，進而在轉錄水平調控這些基因的表達。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三個不 同亞基組成的雜合三聚體。NF-YB蛋白與NF-YC蛋白通過彼此的HFM保守域，采用頭尾相接 的方式形成異源二聚體互作平臺，吸引NF-YA蛋白結合到這個二聚體平臺從而形成具有活 性的異源三聚體核轉錄因子。NF-Y通過NF-YA亞基上的DNA結合域結合到靶基因啟動子部 分的CCAAT盒，執行轉錄激活或轉錄抑制功能。NF-Y的三個亞基的保守域分別具有不同的 蛋白結構域，其中NF-YA保守域具有DNA結合結構域（DNA binding domain)和與NF-YB/ C異源二聚體互作結構域（subunit interaction domain)。NF-YB和NF-YC蛋白保守域則 由組蛋白折疊基序（Histone-fold motif)構成。其中NF-YB與H2B組蛋白折疊基序相似， 而NF-YC與H2A組蛋白折疊基序相似，組蛋白基序由三個α螺旋和兩個環組成，負責H2A/ Η2Β二聚體的形成。
[0008] 到目前為止，已在擬南芥、大豆、玉米、水稻等植物中克隆到NF-Y基因。功能研究 表明，過表達擬南芥的AtNF-YBl顯著提高轉基因擬南芥的抗旱性，進一步研究發現過表達 擬南芥AtNF-YBl的同源基因 ZmNF-YB2,在缺水的條件下轉基因玉米可以顯著增強抗旱性。 轉基因玉米通過提高氣孔導度、降低葉片溫度、防止葉片萎蔫，從而在干旱條件下維持正常 的光合作用，提高了玉米的產量。此外，擬南芥AtNF-YA5被干旱和ABA誘導表達，在維管 束及保衛細胞中特異表達，能夠通過降低氣孔開度，減少水份蒸騰量，以及激活逆境響應基 因，在干旱條件下維持細胞正常滲透勢，通過保持細胞正常生理功能來提高植物的抗旱性。 由于植物的逆境耐性是由多基因調控的復雜性狀，依靠導入單個功能性蛋白基因很難實現 植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關鍵轉錄因子促進多個功能基因的表達，增強植物 的抗逆性，已經成為植物抗逆基因工程的研究熱點。
【發明內容】
[0009] 本發明的一個目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白GmNF_YA2及其編碼基因。 [0010] 本發明提供的蛋白質，為結合CCAAT-box的核轉錄因子蛋白，名稱為GmNF-YA2,來 源于大豆屬大豆（Glycine max L.)，是如下（a)或（b):
[0011] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0012] (b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0013] 序列表中序列1的氨基酸殘基序列是由304個氨基酸殘基組成的蛋白質，其中從 第134個氨基酸殘基到224個氨基酸殘基為保守的組蛋白折疊基序。
[0014] 為了使a)中的GmNF_YA2便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組 成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0015] 表1為標簽的序列
[0016]
[0017] 上述1)中的GmNF-YA2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得 到。上述1中的GmNF-YA2的編碼基因可通過將序列表中序列2的自5'末端第1-915位堿 基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對 的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0018] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發明保護的范圍。
[0019] 上述DNA分子，為如下1) _3)中任一種DNA分子：
[0020] 1)編碼區為序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0021] 2)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分 子；
[0022] 3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分 子。
[0023] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0024] 含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護 的范圍。
[0025] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體，得到表達上述蛋白質的載體。
[0026] 可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體 包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基 因的3'端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導 (Ti)質粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉錄的非 翻譯區均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前 可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動子、玉 米的泛素啟動子（Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使 用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這 些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀 框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于 對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在 植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因（GUS基因、螢光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）或是抗化學試劑標記基因 (如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆 境篩選轉化植株。
[0027] 在本發明的實施例中，表達載體為YEP-GAP，對應的重組載體為 YEP-GAP-GmNF-YA2，YEP-GAP-GmNF-YA2為將上述DNA分子插入YEP-GAP的多克隆位點得到 的重組質粒，優選為將序列表的序列2自5'端第1至915位核苷酸所示的DNA片段插入 YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切識別位點之間得到的重組載體；
[0028] 表達載體為pBI121，對應的重組載體為pBI121-GmNF-YA2，pBI121-GmNF-YA2為將 上述DNA分子插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒，優選為將序列表的序列2自5' 端第1至915位核苷酸所示的DNA片段插入pBI 121的Sma I和SacI酶切識別位點之間得 到的重組載體。
[0029] 擴增上述DNA分子或其任意片段的引物對。
[0030] 所述引物對為 GmNF-YA2-BHI 和 GmNF-YA2-XI 或 GmNF-YA2-121F 和 GmNF-YA2-121R ：
[0031] GmNF-YA2 - BHI :5'-CGGGATCCATGCCGGGGAAAGCTGA-3' ；
[0032] GmNF-YA2-XI :5'-