TAACCTGCCCGCA-3 ’
[0103]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’
[0104]電泳液:0.5%羥乙基纖維素(1300k)溶液，含Ix SYBR Green I，共50 μ L。
[0105]②使用上述試劑盒的檢驗過程包括:
[0106]使用吸潮紙尖擦拭齦溝，取得含有口腔細菌的齦縫液。將吸潮紙尖上沾有齦縫液的尖端部分浸泡在裂解液中3分鐘。取含有細菌細胞內容物的裂解液I μ L，加入PCR反應液。將PCR反應液置于PCR儀內，95°C (預熱)2分鐘，然后設置95°C (變性)10秒、64°C (退火和延伸)30秒兩個溫度階段，循環40次，最后冷卻，共耗時約60分鐘。將電泳液填充入毛細管，將PCR反應液置于樣品位置，電場強度lOOV/cm進樣2秒。然后以電場強度200V/cm電泳，采用熒光檢測。檢測信號如圖2所示，約在0.75分鐘的信號(a)來自于PCR液中的引物；約在2分鐘的信號(b)是來自于Td細菌的311bp的特異性序列，表明樣本中存在Td細菌。PCR儀采用批量操作，每個樣本的平均檢驗時間僅約7分鐘。
[0107]圖2是采用(2)所述試劑盒，經過取樣、裂解、PCR反應和毛細管電泳后得到的檢測信號。圖中，a是PCR反應的引物產生的信號，b是311bp的Td細菌特異性序列產生的信號。
[0108]上述實施例中，無菌取樣器為吸潮紙尖(天津達雅鼎醫療器械有限公司)，裂解液PBS (美國 Sigma-Aldrich 公司)，PCR 反應液 SpeedSTAR HS DNAPolymerase (日本 TAKARA公司)，常規PCR儀TlOO (美國B1Rad公司)，常規毛細管電泳系統(基于Olympus BW53熒光顯微鏡自建)。
[0109]牙銀P卜啉菌(PorphyromonasGingivalis,Pg)
[0110]上游引物:5，-TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3’
[0111]下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0112]齒密螺旋體(TreponemaDenticola,Td)
[0113]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3，
[0114]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’
[0115]以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【主權項】
1.一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于，包括無菌取樣器，的裂解液，PCR反應液和電泳液； 所述無菌取樣器是一用于從口腔中采集細菌樣本的無菌取樣器； 所述裂解液是一用于破壞采集到的細菌的細胞膜，使得細菌細胞的內容物，包括細菌的DNA釋放到溶液中的裂解液； 所述PCR反應液是一用于對Pg細菌、Td細菌中的至少一種的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖的PCR反應液； 所述電泳液是一用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳分離，使得DNA分子的電泳時間與其分子長度呈現正相關的關系的電泳液。
2.根據權利要求1所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:所述無菌取樣器是無菌棉簽、吸潮紙尖中的任意一種。
3.根據權利要求1所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:所述裂解液是 PBS (Phosphate Buffered Saline)。
4.根據權利要求1、2或3所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:所述PCR反應液可以包括:1X Tris緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg細菌的特異性引物200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為: 上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3’ 下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’ 試劑盒保存條件:-20°C。
5.根據權利要求1、2或3所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:所述PCR反應液可以包括:1X Tris緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Td細菌的特異性引物200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為: 上游引物:5 ’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3， 下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’ 試劑盒保存條件:-20°C。
6.根據權利要求1、2或3所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:所述 PCR 反應液包括:1X Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM,DNA聚合酶，以及Pg細菌和Td細菌的特異性引物各200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為: Pg細菌 上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3’ 下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’ Td細菌 上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’ 下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’ 試劑盒保存條件:-20°C。
7.一種用權利要求1所述的牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒來檢驗牙周病病原菌的方法: 步驟一，使用所述無菌取樣器，擦拭齦溝或牙周袋，取得含有口腔細菌的齦縫液； 步驟二，將無菌取樣器沾有齦縫液的部分浸泡在所述裂解液中，使得樣本中的口腔細菌的內容物釋放在溶液中； 步驟三，取步驟二所得到的溶液適量，添加到所述PCR反應液中，給予PCR反應條件，使病原菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖； 步驟四，取步驟三所得到的溶液適量，使用所述電泳液進行毛細管電泳分離和檢測，根據電泳檢測到的DNA情況，得出病原菌的類型。
8.根據權利要求7所述的檢驗牙周病病原菌的方法，其特征在于:上述步驟一中，擦拭齦溝或牙周袋的時間為I分鐘，步驟二中，浸泡時間為3分鐘。
9.根據權利要求7或8所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:步驟三中，取步驟二所得到的溶液I μ L，放置在常規PCR儀中，95°C下預熱2分鐘，然后95°C下變性10秒和64°C下退火和延伸30秒，并反復循環多次，對Pg、Td或兩者同時進行特異性的PCR增殖。
10.根據權利要求9所述的一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于:步驟四中:當使用含有Pg細菌的特異性引物的試劑盒時，若電泳檢測到197bp的DNA，即表明口腔中有Pg細菌，反之則沒有； 當使用含有Td細菌的特異性引物的試劑盒時，若電泳檢測到311bp的DNA，即表明口腔中有Td細菌，反之則沒有； 當使用含有Pg細菌和Td細菌的特異性引物的試劑盒時，若電泳檢測到197bp，表明口腔中含有Pg細菌；若電泳檢測到311bp，表明口腔中含有Td細菌；gl97bp和311bp都被檢測到，表明同時含有Pg和Td兩種細菌；反之，若沒有197bp，則沒有Pg細菌；若沒有31 Ibp，則沒有Td細菌；若197bp和311bp都沒有，則兩種細菌都沒有。
【專利摘要】一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒與檢測方法涉及病原菌的檢驗。一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，包括無菌取樣器，裂解液，PCR反應液和電泳液；所述無菌取樣器是一用于從口腔中采集細菌樣本的無菌取樣器；所述裂解液是一用于破壞采集到的細菌的細胞膜，使得細菌細胞的內容物，包括細菌的DNA釋放到溶液中的裂解液；所述PCR反應液是一用于對Pg細菌、Td細菌中的至少一種的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖的PCR反應液；所述電泳液是一用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳分離，使得DNA分子的電泳時間與其分子長度呈現正相關的關系的電泳液。本發明特異性強，靈敏度高。
【IPC分類】C12Q1-68, C12M1-00, C12Q1-04
【公開號】CN104745447
【申請號】CN201310751906
【發明人】山口佳則, 倪一, 李振慶, 竇曉鳴
【申請人】竇曉鳴, 山口佳則
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月31日