一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒與檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物檢測技術領域，尤其涉及病原菌的檢驗。
【背景技術】
[0002]牙周病僅次于齲病，是危害人類牙齒健康的第二大口腔疾病，通常由齦下菌斑引起。人口腔內的細菌附著在牙齒表面形成牙菌斑，當這些細菌及其產物進入牙齦，會引起牙齦纖維溶解及炎癥，炎癥導致牙槽骨吸收，隨之出現牙齒松動甚至脫落。牙周病不僅會造成不適感和疼痛感，削弱咀嚼能力和消化能力，而且據相關報道，也與中風、冠心病、糖尿病等重大疾病有一定的關系。及時發現牙周病，并加以控制和治療，對牙齒健康具有重要意義。
[0003]目前常用的臨床檢驗方法大多基于傳統的問診方式，通過肉眼觀察牙周袋的形貌，牙齒松動程度等。常用的X光檢驗則只能檢測牙周病造成的骨組織破壞。這些方法都只能適用于對中晚期的、處于發病期的情況進行診斷，很難用于牙周病的預防和早期報告。在最近十年間，隨著人們對牙周病致病菌的深入認識，微生物檢測逐漸得到關注。例如牙齦口卜啉菌(PorphyromonasGingivalis,下文用 Pg 表不)，齒密螺旋體(TreponemaDenticola,下文用Td表示),福賽斯坦納菌(TannerellaForsythensis, Tf)等被認為是與牙周病發病密切相關的特異性細菌。檢測可采用如細菌培養、形態學觀察、熒光抗體法、生化學形狀、代謝產物、酶等多種方法，各種方法各有特點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，以解決上述技術問題。
[0005]本發明的目的還在于提供一種用牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒來檢驗牙周病病原菌的方法。
[0006]本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現:
[0007]—種牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒，其特征在于，包括無菌取樣器，裂解液，PCR反應液和電泳液；
[0008]所述無菌取樣器是一用于從口腔中采集細菌樣本的無菌取樣器；
[0009]所述裂解液是一用于破壞采集到的細菌的細胞膜，使得細菌細胞的內容物，包括細菌的DNA釋放到溶液中的裂解液；
[0010]所述PCR反應液是一用于對Pg細菌、Td細菌中的至少一種的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖的PCR反應液；
[0011]所述電泳液是一用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳分離，使得DNA分子的電泳時間與其分子長度呈現正相關的關系的電泳液。
[0012]所述無菌取樣器可以是無菌棉簽、吸潮紙尖中的任意一種。
[0013]所述裂解液可以是PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0014]所述PCR 反應液可以包括:1X Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg細菌的特異性引物200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為:
[0015]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0016]下游引物:3’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’
[0017]試劑盒保存條件:-20°C，
[0018]用于對Pg細菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖。
[0019]所述PCR 反應液可以包括:1X Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Td細菌的特異性引物200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為:
[0020]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0021]下游引物:3’-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0022]試劑盒保存條件:-20°C，
[0023]用于對Td細菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖。
[0024]所述PCR 反應液包括:1X Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg細菌和Td細菌的特異性引物各200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為:
[0025]Pg 細菌
[0026]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0027]下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0028]Td 細菌
[0029]上游引物:5，-GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’
[0030]下游引物:3，-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0031]試劑盒保存條件:_20°C
[0032]用于同時對Pg和Td細菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖。
[0033]所述試劑盒包含的試劑體積優選不超過200 μ L，以減少試劑盒的體積。
[0034]一種用牙周病病原菌快速檢驗的試劑盒來檢驗牙周病病原菌的方法:
[0035]步驟一，使用所述無菌取樣器，擦拭齦溝或牙周袋，取得含有口腔細菌的齦縫液；
[0036]步驟二，將無菌取樣器沾有齦縫液的部分浸泡在所述裂解液中，使得樣本中的口腔細菌的內容物釋放在溶液中；
[0037]步驟三,取步驟二所得到的溶液適量,添加到所述PCR反應液中，給予PCR反應條件，使病原菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖；
[0038]步驟四，取步驟三所得到的溶液適量，使用所述電泳液進行毛細管電泳分離和檢測，根據電泳檢測到的DNA情況，得出病原菌的類型。
[0039]上述步驟一中，擦拭齦溝或牙周袋的時間優選為I分鐘。
[0040]步驟二中，浸泡時間最好不少于2分鐘，優選3分鐘，以使得內容物充分釋放在溶液中。
[0041]步驟三中，優選取步驟二所得到的溶液適量I μ L0 PCR反應條件可以是將試劑(含樣本)放置在常規PCR儀中，95°C (預熱)2分鐘，然后設置95°C (變性)10秒和64°C (退火和延伸)30秒兩個溫度階段并反復循環多次，對Pg、Td或兩者同時進行特異性的PCR增殖。分析不同樣本的PCR反應條件是相同的，可以對多個樣本同時進行PCR反應，例如常見的32孔、48孔、96孔等。
[0042]步驟四中:當使用含有Pg細菌的特異性引物的試劑盒時，若電泳檢測到197bp的DNA,即表明口腔中有Pg細菌，反之則沒有。當使用含有Td細菌的特異性引物的試劑盒時，若電泳檢測到311bp的DNA，即表明口腔中有Td細菌，反之則沒有。當使用含有Pg細菌和Td細菌的特異性引物的試劑盒時，若電泳檢測到197bp，表明口腔中含有Pg細菌；若電泳檢測到311bp，表明口腔中含有Td細菌；若197bp和311bp都被檢測到，表明同時含有Pg和Td兩種細菌。反之，若沒有197bp，則沒有Pg細菌；若沒有311bp，則沒有Td細菌；若197bp和311bp都沒有，則兩種細菌都沒有。
[0043]本發明的有益效果在于:
[0044]特異性強，靈敏度高。通過PCR反應和特異性引物，樣本中對應于Pg和Td的DNA序列數量得到極大增加，其增殖倍數可達I O9，樣本中的少量Pg和Td細菌就可被檢測到，十分適合早期預報和發現。而樣本中其它來源的DNA數量則不會得到增加，不會干擾目標細菌的檢驗。
[0045]速度快，效率高。當使用本領域人員所知曉的常規PCR儀和常規毛細管電泳設備，每個樣本平均的檢驗時間通常不超過8分鐘。
[0046]試劑盒以及運行成本低。本發明所述試劑盒包含的試劑體積很小，通常不超過200 μ L,因此整個試劑盒的成本，以及分析檢測的運行成本都很低。
【附圖說明】
[0047]圖1是采用(I)所述試劑盒，經過取樣、裂解、PCR反應和毛細管電泳后得到的檢測信號。
[0048]圖2是采用(2)所述試劑盒，經過取樣、裂解、PCR反應和毛細管電泳后得到的檢測信號。
【具體實施方式】
[0049]為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示進一步闡述本發明。
[0050]( I) Pg快速檢驗試劑盒
[0051](1.1)所述Pg快速檢驗試劑盒包括有:無菌取樣器，裂解液，PCR反應液和電泳液。
[0052](1.2)所述無菌取樣器用于從口腔中采集細菌樣本，例如無菌棉簽、吸潮紙尖。
[0053](1.3)所述裂解液用于破壞