采集到的細菌的細胞壁，使得細菌細胞的內容物，包括細菌的DNA釋放到溶液中，例如PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0054](1.4)所述PCR反應液用于對Pg細菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖。其中包括:1X Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM，DNA 聚合酶，以及Pg細菌的特異性引物200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為:
[0055]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0056]下游引物:3，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’
[0057]試劑盒保存條件:-20°C。
[0058](1.5)所述電泳液用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳分離，使得DNA分子的電泳時間與其分子長度呈現正相關的關系。
[0059]( 2 ) Td快速檢驗試劑盒
[0060](2.1)所述Td快速檢驗試劑盒包括有:無菌取樣器，裂解液，PCR反應液和電泳液。
[0061](2.2)所述無菌取樣器用于從口腔中采集細菌樣本，例如無菌棉簽、吸潮紙尖。
[0062](2.3)所述裂解液用于破壞采集到的細菌的細胞膜，使得細菌細胞的內容物，包括細菌的DNA釋放到溶液中，例如PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0063](2.4)所述PCR反應液用于對Td細菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖。其中包括:1X Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM，DNA 聚合酶，以及Td細菌的特異性引物200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為:
[0064]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0065]下游引物:3’ -TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5 ’
[0066]試劑盒保存條件:-20°C。
[0067](2.5)所述電泳液用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳分離，使得DNA分子的電泳時間與其分子長度呈現正相關的關系。
[0068]( 3 )同時快速檢驗Pg和Td的試劑盒
[0069](3.1)所述同時快速檢驗Pg和Td的試劑盒包括有:無菌取樣器，裂解液，PCR反應液和電泳液。
[0070](3.2)所述無菌取樣器用于從口腔中采集細菌樣本，例如無菌棉簽、吸潮紙尖。
[0071](3.3)所述裂解液用于破壞采集到的細菌的細胞膜，使得細菌細胞的內容物，包括細菌的DNA釋放到溶液中，例如PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0072](3.4)所述PCR反應液用于同時對Pg和Td細菌的16S rDNA序列進行特異性的復制增殖。其中包括:ix Tris 緩沖液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg細菌和Td細菌的特異性引物各200nM，上述溶液均以去離子水配制。所述引物序列為:
[0073]Pg 細菌
[0074]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0075]下游引物:3，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’
[0076]Td 細菌
[0077]上游引物:5’-GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’
[0078]下游引物:3，-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0079]試劑盒保存條件:_20°C
[0080](3.5)所述電泳液用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳分離，使得DNA分子的電泳時間與其分子長度呈現正相關的關系。
[0081](4)檢測方法
[0082](I)、(2)或(3)所述的檢驗試劑盒的使用步驟以及檢測方法如下:
[0083]步驟一，使用(1.2),(2.2)或(3.2)所述的無菌取樣器，例如無菌棉簽或吸潮紙尖，擦拭齦溝或牙周袋I分鐘，取得含有口腔細菌的齦縫液。
[0084]步驟二，將無菌取樣器沾有齦縫液的部分浸泡在(1.3)、(2.3)或(3.3)所述的裂解液中，浸泡時間例如3分鐘，使得樣本中的口腔細菌的內容物充分釋放在溶液中。
[0085]步驟三，取步驟二所得到的溶液適量(例如I μ L)，添加到(1.4)、(2.4)或(3.4)所述的PCR反應液中，給予適當的PCR反應條件，例如將試劑(含樣本)放置在常規PCR儀中，950C (預熱)2分鐘，然后設置95°C (變性)10秒和64°C (退火和延伸)30秒兩個溫度階段并反復循環多次，對Pg、Td或兩者同時進行特異性的PCR增殖。分析不同樣本的PCR反應條件是相同的，可以對多個樣本同時進行PCR反應，例如常見的32孔、48孔、96孔等。
[0086]步驟四，取步驟三所得到的溶液適量，使用(1.5)、(2.5)或(3.5)所述的電泳液進行毛細管電泳分離和檢測。毛細管電泳是本領域人員所知曉的一種技術。當使用(I)所述的試劑盒，若電泳檢測到197bp的DNA，即表明口腔中有Pg細菌，反之則沒有。當使用(2)所述的試劑盒，若電泳檢測到311bp的DNA，即表明口腔中有Td細菌，反之則沒有。當使用
(3)所述的試劑盒，若電泳檢測到197bp，表明口腔中含有Pg細菌；若電泳檢測到311bp，表明口腔中含有Td細菌；若197bp和311bp都被檢測到，表明同時含有Pg和Td兩種細菌。反之，若沒有197bp，則沒有Pg細菌；若沒有311bp，則沒有Td細菌；若197bp和31 Ibp都沒有，則兩種細菌都沒有。
[0087]實施例1.參照圖1，口腔中Pg細菌的快速檢驗
[0088]①為快速檢驗Pg細菌設計的試劑盒包含:
[0089]無菌取樣器:吸潮紙尖。
[0090]裂解液:PBS，100yL。
[0091]PCR 反應液:含有 IX Tris 緩沖液(pH=8) 5 μ L ；dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各2.5nM，共4 μ L ;DNA聚合酶0.25 μ L ;Pg細菌的特異性引物200nM,上/下游引物各I μ L ;去離子水37.75 μ L ;共49 μ L。Pg細菌的特異性引物序列為:
[0092]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0093]下游引物:3，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0094]電泳液:0.5%羥乙基纖維素(1300k)溶液，含Ix SYBR Green I，共50 μ L。
[0095]②使用上述試劑盒的檢驗過程包括:
[0096]使用吸潮紙尖擦拭齦溝，取得含有口腔細菌的齦縫液。將吸潮紙尖上沾有齦縫液的尖端部分浸泡在裂解液中3分鐘。取含有細菌細胞內容物的裂解液I μ L，加入PCR反應液。將PCR反應液置于PCR儀內，95°C (預熱)2分鐘，然后設置95°C (變性)10秒、64°C (退火和延伸)30秒兩個溫度階段，循環40次，最后冷卻，共耗時約60分鐘。將電泳液填充入毛細管，將PCR反應液置于樣品位置，電場強度lOOV/cm進樣2秒。然后以電場強度200V/cm電泳，采用熒光檢測。檢測信號如圖1所示，約在0.75分鐘的信號(a)來自于PCR液中的引物；約在1.4分鐘的信號(b)是來自于Pg細菌的197bp的特異性序列，表明樣本中存在Pg細菌。PCR儀采用批量操作，每個樣本的平均檢驗時間僅約7分鐘。圖1是采用(I)所述試劑盒，經過取樣、裂解、PCR反應和毛細管電泳后得到的檢測信號。圖中，a是PCR反應的引物產生的信號，b是197bp的Pg細菌特異性序列產生的信號。
[0097]實施例2.參照圖2，口腔中Td細菌的快速檢驗
[0098]①為快速檢驗Td細菌設計的試劑盒包含:
[0099]無菌取樣器:吸潮紙尖。
[0100]裂解液:PBS，100yL。
[0101]PCR 反應液:含有 IX Tris 緩沖液(pH=8) 5 μ L ；dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各2.5ηΜ#4μ? ;DNA聚合酶0.25 μ L ;Td細菌的特異性引物200ηΜ，上/下游引物各IyL;去離子水37.75 μ L ;共49 μ L。Td細菌的特異性引物序列為:
[0102]上游引物:5’ -GCGTATG