酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及性質改善的酶，以及適用于生產食品、飲料（啤酒）、飼料或生物燃料 (例如在釀造工藝中）的包含所述的酶的組合物。
【背景技術】
[0002] 在啤酒生產中使用酶是公知的。將酶應用于糖化步驟中以改善糖化醪的過濾性并 增加提取產率在WO 97/42302中有所描述。
[0003] W02005118769和W02005059084涉及啤酒生產工藝中的糖化和過濾步驟，并涉及 用于該工藝中的酶組合物。
[0004] W01999057325涉及繩狀青霉（Penicillium funiculosum)菌株，由該菌株得到的 新的酶混合物以及其核心序列。
[0005] 但是，仍需要改善的酶，以及用于食品和飲料產品的生產（例如酒精飲料（例如啤 酒或威士忌）生產中的糖化、烹飪和過濾步驟）中的酶的組合。
[0006] 發明目的
[0007] 本發明的實施方案的目的是提供適用于食品和飲料產品的生產的酶，例如酒精或 非酒精飲料（例如與基于谷物或麥芽的飲料類似的啤酒或威士忌）的生產。所提供的酶具 有與釀造用途有關的改善的性質。這些種類多樣的改善的性質包含例如改善的最適溫度， 改善的對可溶的（WE-AX)與不可溶的（WU-AX)阿拉伯木聚糖底物的活性比，在釀造工藝的 濾除和/或過濾步驟中形成的總壓力降低，以及經酶處理的材料的過濾性增加。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明人發現一種或多種酶以及酶的某些組合相對于已知的酶和酶的組合具有 改善的性質，特別是與釀造工藝中的用途有關，其中在所述的釀造工藝中使用所述一種或 多種酶處理含淀粉的材料，產生釀造糖化醪。
[0010] 因此，在第一個方面中，本發明涉及表現出內切-1，4-β -木聚糖酶活性的酶，該 酶包含與選自以下的任意一者具有至少80%的一致性的氨基酸序列，或它們的任何功能片 段：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6、 SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25。 toon] 如本文所用，"功能片段"是指截短形式的酶，其具有與未截短的參照酶基本相同 的或者至少為有效程度的酶活性。
[0012] 在第二個方面中，本發明涉及表現出內切-1，3 (4)-β-葡聚糖酶活性的酶，該酶 包含與選自以下的任意一者具有至少80%的一致性的氨基酸序列，或它們的任何功能片 段：SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10,和 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16。
[0013] 在第三個方面中，本發明涉及DNA構建體，其包含編碼根據本發明的酶的DNA序 列。
[0014] 在另一個方面中，本發明涉及包含DNA構建體的重組表達載體，其中所述的DNA構 建體包含編碼根據本發明的酶的DNA序列。
[0015] 在另一個方面中，本發明涉及使用DNA構建體轉化的細胞，其中所述的DNA構建體 包含編碼根據本發明的酶的DNA序列。
[0016] 在另一個方面中，本發明涉及包含根據本發明的酶、DNA構建體、載體或細胞的制 備物。
[0017] 在另一個方面中，本發明涉及組合物，其包含根據本發明的表現出內 切-1，4- β -木聚糖酶活性的酶、以及任意一種或多種β -葡聚糖酶。
[0018] 在另一個方面中，本發明涉及組合物，其包含根據本發明的表現出內 切-1，3 (4) - β -葡聚糖酶活性的酶、以及任意一種或多種木聚糖酶。
[0019] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在食品、飼料或麥芽飲料產品（例如啤酒或威士忌）生產中的用途。
[0020] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在生面團或烘焙產品的生產中的用途。
[0021] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在紙漿或紙的制備中的用途。
[0022] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在谷物成分的制備中的用途。在一些實施方案中，谷物為黑麥、小麥或大麥。
[0023] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在啤酒生產或釀造工藝副產物的改性中的用途。
[0024] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在葡萄酒或果汁的生產中的用途。
[0025] 在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的酶、或根據本發明的制備物或根據本 發明的組合物在一代或二代生物燃料例如生物乙醇的生產中的用途。
[0026] 在另一個方面中，本發明涉及改變含淀粉材料的過濾性的方法，該方法包括使用 根據本發明的酶、制備物或組合物來處理所述的含淀粉材料的步驟。
[0027] 在另一個方面中，本發明涉及降低在釀造應用的濾除過程中產生的壓力的方法， 該方法包括使用根據本發明的酶、制備物或組合物來處理釀造糖化醪的步驟。
[0028] 在另一個方面中，本發明涉及食品、飼料或飲料產品（例如酒精或非酒精飲料，例 如與基于谷物或麥芽的飲料類似的啤酒或威士忌）的生產方法，該方法包括使用根據本發 明的酶、制備物或組合物來處理含淀粉材料的步驟。
[0029] 在另一個方面中，本發明涉及用于生產釀造糖化醪的方法，該方法包括使用根據 本發明的酶、制備物或組合物來處理含淀粉材料的步驟。
[0030] 在另一個方面中，本發明涉及用于生產一代或二代生物燃料例如生物乙醇的方 法，該方法包括使用根據本發明的酶、制備物或組合物來處理含淀粉材料的步驟。
[0031] 在另一個方面中，本發明涉及通過根據本發明的方法獲得的產物。
[0032] 在另一個方面中，本發明涉及組合物，其包含通過根據本發明的方法獲得的產物， 例如其中所述的產物為〇. 1% -99. 9%。
[0033] 圖例
[0034] 圖I :試驗室規模和中試規模釀造中使用的糖化圖譜。糖化是以IOmin糖化期為 開始，其后加入酶。
[0035] 圖2 :中試規模的釀造應用產生于葡聚糖酶和木聚糖酶篩選的證實。針對空白和 UltraFlo max來檢驗枯草芽胞桿菌（B. sub)葡聚糖酶S和A. tub木聚糖酶。收集的數據為 平均流速（L/h)，經過濾除過程的形成的總壓力（mm WC，其中Imm WC = 9. 80665 Pa)以及 在濾除過程中的最大壓力（mm WC)。
[0036] 33圖3 :釀造中木聚糖酶的功能性。
[0037] 34圖4 :濾除流速，其中施加多種木聚糖酶的候選物。
[0038] 35圖5 :啤酒過濾-重復過濾的平均值。
[0039] 36圖6 :啤酒過濾-重復過濾的平均值。
[0040] 圖7 :實施例3的糖化克數。
[0041] 本發明的詳細公開
[0042] 在傳統上，啤酒是指由麥芽（例如由大麥粒得到的麥芽）、和可任選的附屬物（例 如含淀粉的植物材料（例如谷物谷粒）和可任選的加入風味劑（例如可加入啤酒花）得到 的酒精飲料。
[0043] 就本發明而言，術語"啤酒"是指包含通過發酵/釀造含淀粉的植物材料而生產的 任何發酵的麥芽汁，因此也特別包含專門由附屬物、或者麥芽和附屬物的任何組合所生產 的啤酒。
[0044] 就本發明而言，術語"發酵"是指通過使微生物在培養物中生長來生產諸如乙醇之 類的物質。通常諸如酵母之類的微生物可用于發酵。
[0045] 如本文所用，術語"麥芽"可理解為任何發芽的谷物谷粒，例如發芽的大麥。"附屬 物"可定義為并非為麥芽或大麥麥芽的任何含淀粉的植物材料。
[0046] "含淀粉的植物材料"可以為例如一種或多種谷物，例如大麥、小麥、玉米、黑麥、高 粱、小米或大米和它們的任意組合。含淀粉的植物材料可以被加工，例如研磨的、發芽的、部 分發芽的或未發芽的。未發芽的谷物也稱為"天然谷粒"。非谷物的含淀粉植物材料的實例 包括例如塊莖，例如馬鈴薯和木薯。
[0047] 如本文所用，術語"飲料"和"飲料產物"包括形成泡沫的發酵的飲料，例如全麥啤 酒、在"純凈法（Reinheitsgebot) "下釀造的啤酒、愛爾啤酒、干啤酒、淡啤酒、清淡啤酒、低 醇啤酒、低熱量啤酒、波特啤酒、博克啤酒、黑啤酒、麥芽酒、無醇啤酒、無醇麥芽酒等。此外， 術語"飲料"或"飲料產物"還包括不起沫的啤酒和備選的麥芽飲料，例如果味的麥芽飲料， 例如柑橘風味的，例如檸檬、橙子、青檸或漿果風味的麥芽飲料；酒味的麥芽飲料，例如伏特 加、朗姆或龍舌蘭風味的麥芽酒；或者咖啡風味的麥芽飲料，例如咖啡因風味的麥芽酒等。 [0048] 可以通過基本相同的工藝由多種含淀粉的植物材料來制得啤酒，其中所述的淀粉 主要由葡萄糖均聚物組成，在該均聚物中，葡萄糖殘基通過α-1,4-或α-1,6-鍵連接，并 且主要為α-1,4-鍵。
[0049] 制造發酵的飲料（例如啤酒）的工藝通常稱為釀造。在制造這些飲料中使用的傳 統的原材料為水、啤酒花和麥芽。此外或者代替麥芽，諸如普通玉米粒、精制玉米渣、釀造 者的酵母粉、大米、高粱、精制玉米淀粉、大麥、大麥淀粉、脫殼大麥、小麥、小麥淀粉、烘焙谷 物、谷物片、黑麥、燕麥、馬鈴薯、木薯粉、糖漿（例如玉米糖漿、甘蔗糖漿、轉化糖漿、大麥和 /或小麥糖漿）等之類的附屬物可以用作淀粉的來源。淀粉最終通過酶促而轉化成可發酵 的糖。
[0050] 關于主要由麥芽（例如至多達到15-20%附屬物）制造的啤酒，由于多種原因，使 得麥芽（主要由所選種類的大麥生產）對啤酒的整體特征和品質產生最大的影響。首選， 麥芽是啤酒中主要的風味劑。第二，麥芽提供了可發酵的糖的主要部分。第三，麥芽提供了 蛋白質，這有助于啤酒的主體和泡沫特征。第四，麥芽提供了糖化過程中必須的酶活性。
[0051] 此外，啤酒花還極其有助于啤酒的品質，包含風味。具體而言，啤酒花（或啤酒花 的構成部分）將所需的苦味物質加入到啤酒中。此外，啤酒花起到了蛋白質沉淀劑的作用， 形成了防腐劑，并有助于泡沫的形成和穩定。并非所有的啤酒都是使用啤酒花生產的。諸 如蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）之類的其他穩定劑也可以使用。
[0052] 不想解釋為限宙本發明，以下描沭傳統的釀誥工藝：
[0053] 用于制造啤酒的工藝是本領域公知的，但是簡言之，該工藝涉及5個步驟：(a)糖 化和/或附屬物的烹飪；(b)麥芽汁的分離和提取；(C)麥芽汁的煮沸并加入啤酒花；（d)冷 卻、發酵和儲存；以及（e)成熟、加工和包裝。通常，在第一個步驟中，將研磨或壓碎的麥芽 與水混合，在受控的溫度下保持一段時間，從而使麥芽中存在的酶將麥芽中存在的淀粉轉 化成可發酵的糖。
[0054] 在第二個步驟中，糖化醪被轉移至"過濾桶"或糖化醪過濾器中，在此，液體與谷粒 殘余物分離