結(jié)果，圖3Β為免疫印跡分析結(jié)果。
[0046] 圖4表示無異源成分的血清替代物比例對培養(yǎng)12天時PLZF陽性類精原干細胞形 成率的影響。其中，圖4A、4B、4C分別所示，添加0. 2%牛血清白蛋白（BSA)、0. 2%無異源 成分的血清替代物（KnockOut SR XenoFree)、1 %無異源成分的血清替代物（KnockOut SR XenoFree)〇
[0047] 圖5表示在無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，飼養(yǎng)層細胞對培養(yǎng)12天 PLZF陽性類精原干細胞陽性率影響。其中，圖5A表示分化過程無飼養(yǎng)層細胞，圖5B表示分 化過程含有飼養(yǎng)層細胞。
[0048] 圖6A表示無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)12天，流式細胞儀分 析檢測Hl胚胎干細胞分化體系中的PLZF陽性類精原干細胞比率；圖6B表示P2618男性來 源NOA癥誘導多能干細胞分化體系中的PLZF陽性類精原干細胞比率。
[0049] 圖7表示在無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，Hl男性來源人胚胎干細 胞、P2618男性來源NOA癥誘導多能干細胞培養(yǎng)12天，體系中產(chǎn)生中VASA、PLZF、GPR125、 CD90精原干細胞分子標記陽性的類精原干細胞。
[0050] 圖8A表示對照組Hl人胚胎干細胞H19印記基因上游區(qū)域甲基化分布。圖8B表 示在無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，Hl男性來源人胚胎干細胞、P2618男性來 源NOA癥誘導多能干細胞培養(yǎng)12天，產(chǎn)生的PLZF陽性細胞的H19印記基因上游區(qū)域，呈現(xiàn) 高度甲基化。
[0051] 圖9A表示無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)12天，流式細胞儀分 析檢測Hl胚胎干細胞分化體系中的單倍體細胞（IN)比率；圖9B表示P2618男性來源NOA 癥誘導多能干細胞分化體系中的單倍體細胞（IN)比率。
[0052] 圖10為無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，Hl男性來源人胚胎干細胞、 P2618男性來源NOA癥誘導多能干細胞培養(yǎng)12天，采用流式細胞儀分選、富集體系中單倍體 細胞（IN)，并利用細胞免疫焚光檢測AcrosiruPrml單倍體分子標記。
[0053] 圖11為無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，Hl男性來源人胚胎干細胞、 P2618男性來源NOA癥誘導多能干細胞培養(yǎng)12天，采用流式細胞儀分選、富集體系中單倍 體細胞（IN)，并利用基因組重亞硫酸鹽測序方法檢測到H19印記基因上游區(qū)域呈高度甲基 化。
【具體實施方式】
[0054] 結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容 不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變 化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、 條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識， 本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0055] 實施例1~4 :H1男性來源胚胎干細胞、P2618男性來源NOA癥誘導多能干細胞分 化產(chǎn)生類精原干細胞、單倍體細胞
[0056] 接種培養(yǎng)方法步驟：
[0057] 將Hl男性來源人胚胎干細胞、P2618男性來源NOA癥誘導多能干細胞接種于培養(yǎng) 皿，待細胞生長達到培養(yǎng)皿90 %匯合狀態(tài)時，用無鈣鎂磷酸鹽緩沖液洗滌細胞一次，更換為 無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液，置于37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每48小時更換等 體積新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)12天，采用流式細胞儀分析PLZF陽性類精原干細胞比率，并細胞免 疫熒光檢測VASA、PLZF、GPR125、CD90精原干細胞分子標記；富集PLZF陽性細胞，提取基因 組，亞硫酸鹽修飾，巢式PCR擴增H19印記基因上游區(qū)域，連接T載體測序，軟件分析統(tǒng)計擴 增區(qū)段甲基化修飾情況。綜合上述分子生物學、細胞生物學檢測結(jié)果，評判培養(yǎng)過程中是否 出現(xiàn)類精原干細胞。同時，采用流式細胞儀分析體系中單倍體細胞比率，流式細胞儀富集單 倍體細胞，免疫熒光檢測Acrosin、Prml單倍體細胞分子標記，重亞硫酸鹽測序法檢測H19 印記基因上游區(qū)域甲基化情況，綜合上述分子生物學、細胞生物學檢測結(jié)果，評判培養(yǎng)體系 中是否出現(xiàn)單倍體細胞。
[0058] 各實施例中所用的無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液的配方，見表1。在其他實施例 中，培養(yǎng)液中可以用10ng/mL、40ng/mL、10~40ng/mL范圍內(nèi)任一數(shù)值的重組人神經(jīng)膠質(zhì)源 神經(jīng)營養(yǎng)因子；可以用0. l%、〇. 2%、0. 1~0. 2%范圍內(nèi)任一數(shù)值的脂質(zhì)濃縮物；可以用 50ug/mL、200ug/mL、50-200ug/mL 范圍內(nèi)任一數(shù)值的維生素 C。
[0059] 實驗結(jié)果：Hl男性來源人胚胎干細胞、P2618男性來源NOA癥誘導多能干細胞在無 血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液（如表1所示）條件下，培養(yǎng)12天，培養(yǎng)得到的產(chǎn)物經(jīng)細胞生 物學、分子生物學檢測，體系中可見VASA陽性、PLZF陽性、GPR125陽性、⑶90陽性細胞，且 H19印記基因上游區(qū)域呈現(xiàn)高度甲基化的類精原干細胞，可見AcrosiruPrml陽性，H19印記 基因上游區(qū)域呈現(xiàn)高度甲基化的單倍體細胞。
[0060] 表 1
[0061]
【主權(quán)項】
1. 一種人多能干細胞向生殖細胞分化的無動物源組分培養(yǎng)方法，其特征在于，在無血 清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液的條件下，使男性來源多能干細胞在體外分化過程中產(chǎn)生類精 原干細胞、單倍體細胞；其中，所述無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液包括無血清、無動物源性 蛋白培養(yǎng)液I、無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液II: 所述無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液I包括： MEM培養(yǎng)基； 青霉素/鏈霉素雙抗溶液1 % ; L-谷氨酰胺2mM; 4-羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM; 膜島素_轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物1 % ; 無異源成分的血清替代物0.2-3%; 堿性成纖維細胞生長因子Ing/mL; 重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子10-40ng/mL; a-巰基乙醇0?ImM; 脂質(zhì)濃縮物0.1-0. 2%; 所述無血清、無動物源性蛋白的培養(yǎng)液II包括： MEM培養(yǎng)基； 青霉素/鏈霉素雙抗溶液1 % ; L-谷氨酰胺2mM; 4-羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM; 膜島素_轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物1 % ; 無異源成分的血清替代物0.2-3%; 堿性成纖維細胞生長因子Ing/mL; 重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子10-40ng/mL; 維生素C50-200ug/mL; 脂質(zhì)濃縮物0.1-0. 2%。
2. 如權(quán)利要求一種人多能干細胞向生殖細胞分化的無動物源組分培養(yǎng)方法，其特征在 于，在男性來源多能干細胞在體外分化過程中使用無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液I或無 血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液II。
3. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，當男性來源多能干細胞生長達到培養(yǎng) 皿生長面積90%匯合狀態(tài)時，使用所述無血清、無動物源性蛋白的培養(yǎng)液。
4. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法在37°C、5%CO2飽和濕 度條件下進行。
5. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法中，男性來源多能干細胞 培養(yǎng)8~25天可得到類精原干細胞、單倍體細胞。
6.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述類精原干細胞為VASA陽性、PLZF 陽性、GPR125陽性、CD90陽性，且H19印記基因上游區(qū)域高度甲基化類的精原干細胞；所 述單倍體細胞為Acrosin陽性、Prml陽性，及H19印記基因上游區(qū)域高度甲基化的單倍體 細胞。
7. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法在男性來源多能干細胞分化 過程中無飼養(yǎng)層細胞。
8. -種無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液，其特征在于，為無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng) 液I，其包括： MEM培養(yǎng)基； 青霉素/鏈霉素雙抗溶液1 % ; L-谷氨酰胺2mM; 4-羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM; 膜島素_轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物1 % ; 無異源成分的血清替代物0.2-3%; 堿性成纖維細胞生長因子Ing/mL; 重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子10-40ng/mL;a-巰基乙醇0?ImM; 脂質(zhì)濃縮物0.1-0. 2%。
9. 一種無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液，其特征在于，為無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng) 液II，其包括： MEM培養(yǎng)基； 青霉素/鏈霉素雙抗溶液1 % ; L-谷氨酰胺2mM; 4-羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM; 膜島素_轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物1 % ; 無異源成分的血清替代物0.2-3%; 堿性成纖維細胞生長因子Ing/mL; 重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子10-40ng/mL; 維生素C50-200ug/mL; 脂質(zhì)濃縮物0.1-0. 2%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于男性來源多能干細胞向生殖細胞分化的無動物源性組分培養(yǎng)方法，在無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液的條件下，使男性來源多能干細胞在體外分化過程中產(chǎn)生類精原干細胞、單倍體細胞。本發(fā)明還公開了一種無血清、無動物源性蛋白培養(yǎng)液體系。本發(fā)明提出的無血清、無動物源蛋白培養(yǎng)方法，操作簡單、可重復性強，具有廣泛的臨床應用價值，為生殖細胞發(fā)生機理研究，及男性非梗阻性無精子癥的診斷、治療提供了基本技術(shù)平臺。
【IPC分類】C12N5-076
【公開號】CN104726400
【申請?zhí)枴緾N201510094574
【發(fā)明人】王媛, 趙云程, 馬慶, 孔睿佼, 龔雪萍
【申請人】華東師范大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月3日