人多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無(wú)動(dòng)物源組分培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人多能干細(xì)胞的生物技術(shù)，具體涉及一種人多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分 化的無(wú)動(dòng)物源組分培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前全世界約有六分之一的育齡夫婦不育，其中男性因素占50% (Hirsh 2003)。 研宄表明，歐洲20%的男性不育患者屬于無(wú)精子癥（Bhasin，de Kretser et al. 1994)， 而這一比例在中國(guó)男性不育患者中高達(dá)25% (Wu，Lu et al.2007);同時(shí)，49%到93% 的無(wú)精子癥患者屬于睪丸本身功能障礙，即原發(fā)性非梗阻性無(wú)精癥（Non-obstructive azoospermia，NOA)(Hayashi, Saitou et al. 2012)。NOA 癥患者臨床表現(xiàn)為生精細(xì)胞的匱 乏與缺失，尚無(wú)有效藥物治療方案，采用捐精者精液進(jìn)行人工授精是目前NOA癥"治療"途 徑之一。
[0003] 近年來，大量研宄表明，人胚胎干細(xì)胞（Human Embryonic Stem Cells，hES)、人 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Human Induced Pluripotent Stem Cells，hiPSC)(統(tǒng)稱為"人多能干細(xì) 胞"），具備體外分化產(chǎn)生生殖細(xì)胞的能力（Tilgner, Atkinson et al. 2008 ;Bucay, Yebra et al. 2009 ；Kee,Angeles et al. 2009 ；Park, Galic et al. 2009 ；Tilgner, Atkinson et al.2010 ；Eguizabal, Montserrat et al.2011 ；Medrano,Ramathal et al.2011 ； Easley, Phillips et al. 2012 ；Gkountela, Li et al. 2013 ；Hayashi and Saitou 2013)， 尤以iPS技術(shù)的出現(xiàn)（Takahashi，Tanabe et al. 2007)，人們陸續(xù)獲得NOA癥亞型"Y 染色體微缺失癥"病理iPS細(xì)胞系，研宄表明Y染色體缺失癥iPS細(xì)胞系在小鼠睪丸體 內(nèi)分化過程中，生殖細(xì)胞比率顯著低于對(duì)照組，表現(xiàn)出與NOA癥病理特征驚人的相似性 (Ramathal, Durruthy-Durruthy et al. 2014)，相關(guān)研宄為NOA癥致病機(jī)制研宄、病理診斷、 臨床治療提供了嶄新的技術(shù)手段。然而令人遺憾的是，目前所報(bào)道的多能干細(xì)胞向生殖細(xì) 胞體外、體內(nèi)分化體系，均存在效率低下、培養(yǎng)成分不明（血清）、存在大量動(dòng)物源"污染"等 (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)、裸鼠體內(nèi)分化），嚴(yán)重制約NOA癥病理機(jī)制研宄及臨床治療 推廣與應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明以此為切入點(diǎn)，克服現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，結(jié)合多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分 化的最新研宄，通過大量試驗(yàn)組合摸索，構(gòu)建了一種全新的男性來源多能干細(xì)胞向生殖細(xì) 胞分化的無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源蛋白培養(yǎng)體系及培養(yǎng)方法，具有科學(xué)性、實(shí)踐性及廣泛的臨床應(yīng) 用價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明的目的之一在于，提供一種用于男性來源多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無(wú) 血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)方法，在采用無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液的條件下，使男 性來源多能干細(xì)胞體外分化過程中產(chǎn)生類精原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞，從而拓展了哺乳動(dòng)物 多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生生殖細(xì)胞的研宄領(lǐng)域。
[0006] 本發(fā)明中，男性來源多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源蛋白培養(yǎng)體 系包括任意一種培養(yǎng)液，即無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液I和無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培 養(yǎng)液II。其中，所述無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液I包括:MEM培養(yǎng)基；青霉素/鏈霉素雙 抗溶液1% ;L-谷氨酰胺2mM ;4_羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM ;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X添加 物1% ;無(wú)異源成分的血清替代物〇. 2-3% ;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ing/mL ;重組人神經(jīng) 膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子10-40ng/mL ; α -疏基乙醇〇. ImM ;脂質(zhì)濃縮物〇. 1-0. 2%。所述無(wú)血 清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液II包括：MEM培養(yǎng)基；青霉素/鏈霉素雙抗溶液1 % ;L-谷氨酰 胺2mM ;4_輕乙基哌嘆乙磺酸IOmM ;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X添加物1 % ;無(wú)異源成分的 血清替代物〇. 2-3% ;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ing/mL ;重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 10-40ng/mL ;維生素 C 50-200ug/mL ;脂質(zhì)濃縮物 0· 1-0. 2%。
[0007] 本發(fā)明中，MEM培養(yǎng)基是指一種廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最低必需培 養(yǎng)液，購(gòu)于 Invitrogen 公司的 Minimum Essential Medium(MEM) α，其商標(biāo)編號(hào)為 12561-056。
[0008] 本發(fā)明中，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X添加物是指胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒、乙醇胺 的混合添加組分，被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)中，對(duì)細(xì)胞能量代謝、抗氧化、鐵 離子運(yùn)輸、氧分壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞器組成具有十分重要的作用。胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X購(gòu) 于 Invitrogen 公司的 Insulin-Transferrin-Selenium-X，商標(biāo)編號(hào)為 51500,其產(chǎn)品說 明書提供的具體組分包括如下：亞硒酸鈉（無(wú)水）〇. 〇〇〇67g/L ;胰島素 I. 00g/L ;轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.55g/L;乙醇胺 0.20g/L。
[0009] 本發(fā)明中，所述無(wú)異源成分的血清替代物，是指一種完全人工合成、無(wú)動(dòng)物源 蛋白污染、適合于臨床研宄的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)組分。無(wú)異源成分的血清替代物購(gòu)于 Invitrogen 公司的 KnockOut? SR XenoFree CTS?，商標(biāo)編號(hào)為 A10992-01 〇
[0010] 本發(fā)明中，所述脂質(zhì)濃縮物是指一種化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮混合液，是指一種 用于脊椎動(dòng)物細(xì)胞、非脊椎動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的油脂添加成分，其對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量供 給具有重要作用。所述脂質(zhì)濃縮物即化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物購(gòu)于Invitrogen公司 的Chemically Defined Lipid Concentrate，商標(biāo)編號(hào)為11905031，其產(chǎn)品說明書提供的 具體組分包括如下：花生四烯酸2. 0mg/L ;膽固醇220. 0mg/L ;維生素 E-醋酸酯70.0 mg/ L ;乙醇100 % ;亞油酸10. 0mg/L ;亞麻酸10. 0mg/L ;肉豆蔻酸10. 0mg/L ;油酸10.0 mg/ L ;棕櫚酸10. 0mg/L ;棕櫚油酸10. 0mg/L ;泊洛沙姆90000. 0mg/L ;硬脂酸10. 0mg/L ;吐 溫-802200. 0mg/L。
[0011] 本發(fā)明中，所述無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液中，青霉素/鏈霉素雙抗溶液、 L-谷氨酰胺、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、α -巰基乙醇等原料均可購(gòu)于Invitrogen公司。 4-羥乙基哌嗪乙磺酸可購(gòu)于Amresc0公司。重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子購(gòu)于Sino Biological Inc.公司。
[0012] 較佳地，所述無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液I包括:MEM培養(yǎng)基；1 %青霉素/鏈 霉素雙抗溶液；2mM L-谷氨酰胺；IOmM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸；1 %胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X 添加物；0.2%無(wú)異源成分的血清替代物；11^/1^堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；20叩/11^重組 人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；〇. ImMa -巰基乙醇；0. 2%脂質(zhì)濃縮物。
[0013] 本發(fā)明中，所述無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)液II可以包括：MEM培養(yǎng)基；青霉 素/鏈霉素雙抗溶液I % ;L-谷氨酰胺2mM ;4_羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM ;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋 白-硒-X添加物1% ;無(wú)異源成分的血清替代物0. 2-3% ;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ing/ mL ;重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子10-40ng/mL ;維生素 C 50-200ug/mL ;脂質(zhì)濃縮物 0· 1-0. 2%〇
[0014] 較佳地，所述無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)液II為：MEM培養(yǎng)基；1 %青霉素/鏈 霉素雙抗溶液；2mM L-谷氨酰胺；IOmM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸；1 %胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X 添加物；1 %無(wú)異源成分的血清替代物；Ing/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Invitrogen); 20ng/mL重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；維生素 C 200ug/mL ;0. 2%化學(xué)成分確定的脂質(zhì) 濃縮物。
[0015] 本發(fā)明提出的男性來源多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源蛋白培養(yǎng) 方法中，當(dāng)男性來源多能干細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)皿生長(zhǎng)面積90%匯合狀態(tài)時(shí)，更換使用所述 無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)液。本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)并首次提出了多能干細(xì)胞密度對(duì)類精 原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞獲得率的影響，研宄發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致類精原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞獲得率較低 的主要原因之一是由于細(xì)胞密度過低。本發(fā)明提出了培養(yǎng)體系適宜的細(xì)胞密度，如，當(dāng)男性 來源多能干細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)皿生長(zhǎng)面積不小于90%匯合狀態(tài)時(shí)為佳。
[0016] 本發(fā)明方法中使用本發(fā)明所述無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)液能夠從男性來源 多能干細(xì)胞獲得類精原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞，在男性來源多能干細(xì)胞在體外分化過程中使 用無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液I，或選擇使用無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液II，進(jìn)一 步提尚細(xì)胞分化效果。
[0017] 本發(fā)明中，在男性來源多能干細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合狀態(tài)之前所采用的培養(yǎng)液為現(xiàn) 有技術(shù)通用的人多能性干細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0018] 本發(fā)明中，在37°C、5% CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0019]