本發(fā)明中，所述男性來源多能干細(xì)胞培養(yǎng)8~25天可得到類精原干細(xì)胞、單倍體 細(xì)胞。較佳地，培養(yǎng)10~15天。較佳地，培養(yǎng)12天。
[0020] 本發(fā)明中，培養(yǎng)得到的類精原干細(xì)胞為VASA陽性、PLZF陽性、GPR125陽性、⑶90 陽性，且H19印記基因上游區(qū)域高度甲基化的類精原干細(xì)胞。培養(yǎng)得到的單倍體細(xì)胞為 Acrosin陽性、Prml陽性，及H19印記基因上游區(qū)域高度甲基化的單倍體細(xì)胞。其中，培 養(yǎng)產(chǎn)物中，類精原干細(xì)胞與單倍體細(xì)胞的比例可以是任意比例，依實(shí)驗(yàn)具體情況均可。較佳 地，類精原干細(xì)胞的比例為10~85%，單倍體細(xì)胞比率2~8%。
[0021] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明用于男性來源多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無血 清、無動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)方法為，待男性來源多能干細(xì)胞生長至90%匯合狀態(tài)時(shí)，將通用 的人多能性干細(xì)胞培養(yǎng)液更換為所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液，置于37°0、5%〇) 2飽 和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每48h全量更換培養(yǎng)液，pH為6. 8-7. 2,培養(yǎng)12天，則體系中 可獲得VASA陽性、PLZF陽性、GPR125陽性、CD90陽性，且H19印記基因上游區(qū)域高度甲基 化的類精原干細(xì)胞，和Acrosin陽性、Prml陽性、H19印記基因上游區(qū)域高度甲基化的單倍 體細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明培養(yǎng)方法中，每48h更換所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液。在換液前， 用無鈣鎂磷酸鹽緩沖液洗滌一次，去除死細(xì)胞對(duì)后續(xù)分化的影響。分化培養(yǎng)前8天，細(xì)胞死 亡較多，死亡細(xì)胞殘留對(duì)后期分化產(chǎn)生影響。
[0023] 本發(fā)明培養(yǎng)方法，采用所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)技術(shù)體系，能使男性來 源多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生VASA陽性、PLZF陽性、GPR125陽性、⑶90陽性、H19印記基因上游 區(qū)域高度甲基化的類精原干細(xì)胞，和Acrosin陽性、Prml陽性、H19印記基因上游區(qū)域高度 甲基化的單倍體細(xì)胞。
[0024] 本發(fā)明還提出一種無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液，為無血清、無動(dòng)物源性蛋白培 養(yǎng)液I，用于男性來源多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無血清、無動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)方法 中，其包括：MEM培養(yǎng)基；青霉素/鏈霉素雙抗溶液1 % ;L-谷氨酰胺2mM ;4_羥乙基哌嗪乙 磺酸IOmM ;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X添加物1% ;無異源成分的血清替代物0. 2-3% ;堿性 成纖維細(xì)胞生長因子Ing/mL ;重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子10-40ng/mL ; α -巰基乙醇 〇. ImM ;脂質(zhì)濃縮物〇. 1-0. 2%。
[0025] 較佳地，所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液I包括:MEM培養(yǎng)基；1 %青霉素/鏈 霉素雙抗溶液；2mM L-谷氨酰胺；IOmM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸；1 %胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X 添加物；0. 2 %無異源成分的血清替代物；Ing/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子；20ng/mL重組 人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子；〇. ImMa -巰基乙醇；0. 2%脂質(zhì)濃縮物。
[0026] 本發(fā)明還提出了另一種無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液II，用于男性來源多能干 細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的無血清、無動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)方法中，其包括：MEM培養(yǎng)基；青霉 素/鏈霉素雙抗溶液1 % ;L-谷氨酰胺2mM ;4_羥乙基哌嗪乙磺酸IOmM ;胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋 白-硒-X添加物1% ;無異源成分的血清替代物0. 2-3% ;堿性成纖維細(xì)胞生長因子Ing/ mL ;重組人神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子10-40ng/mL ;維生素 C 50-200ug/mL ;脂質(zhì)濃縮物 0· 1-0. 2%〇
[0027] 較佳地，所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白的培養(yǎng)液II為：MEM培養(yǎng)基；1 %青霉素/鏈 霉素雙抗溶液；2mM L-谷氨酰胺；IOmM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸；1 %胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-X 添加物；1 %無異源成分的血清替代物；Ing/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子；20ng/mL重組人 神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營養(yǎng)因子；維生素 C 200ug/mL ;0. 2%脂質(zhì)濃縮物。
[0028] 其中，所述無血清、無動(dòng)物源性培養(yǎng)液用于人多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的培養(yǎng) 體系中。
[0029] 其中，所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液不含血清、不含動(dòng)物源性蛋白，成分明 確，重復(fù)性強(qiáng)，適用于臨床醫(yī)用。所述培養(yǎng)液應(yīng)避光、4°C保存。本發(fā)明無血清、無動(dòng)物源性 蛋白培養(yǎng)方法，不含有任何動(dòng)物來源的添加組分。本發(fā)明培養(yǎng)方法及培養(yǎng)液中所用藥劑均 為市售產(chǎn)品。
[0030] 本發(fā)明培養(yǎng)體系中起重要影響作用的因素包括：男性來源多能干細(xì)胞接種密度； 無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液：
[0031] 男性來源多能干細(xì)胞接種密度：細(xì)胞旁分泌對(duì)干細(xì)胞增殖、分化有重要影響。本發(fā) 明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件下，男性來 源多能干細(xì)胞密度對(duì)后期類精原干細(xì)胞形成率有顯著影響。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)男 性來源多能干細(xì)胞接種密度從30 %匯合提升至90 %匯合時(shí)，采用本發(fā)明所述無血清、無動(dòng) 物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)12天，獲得PLZF陽性類精原干細(xì)胞比率由34. 6%提高至63. 9%， 見圖1。
[0032] 無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液：本發(fā)明人參考現(xiàn)有技術(shù)中的人多能干細(xì)胞無血 清培養(yǎng)體系，采用所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，從影響多能干細(xì)胞增 殖、凋亡，促進(jìn)生殖細(xì)胞分化等多個(gè)角度，進(jìn)行了大量優(yōu)化組合試驗(yàn)。研宄發(fā)現(xiàn)，在所述無血 清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件下，α -巰基乙醇、維生素 C對(duì)細(xì)胞增殖均有顯著影 響。具體實(shí)施例中，當(dāng)在培養(yǎng)液中撤去α-巰基乙醇時(shí)，細(xì)胞存活率顯著增加，見圖2。在培 養(yǎng)液中添加維生素 C則顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，見圖2。在培養(yǎng)液中同時(shí)撤去α-巰基乙醇并添 加維生素 C，男性來源多能干細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，細(xì)胞增殖明顯，見圖2。
[0033] 本發(fā)明進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)體系中撤去α -巰基乙醇、添加維生素 C，男性來 源多能干細(xì)胞采用所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)12天，PLZF陽性類精原干細(xì)胞 比率會(huì)進(jìn)一步提高，由52. 8%提高至77. 7%，見圖3。免疫印跡法檢測到PLZF蛋白表達(dá)量 提高1.5倍，見圖3。
[0034] 現(xiàn)有技術(shù)中牛血清白蛋白（BSA)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，但因其批次不 穩(wěn)定性、含有動(dòng)物源成分等因素，使得相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在臨床推廣與應(yīng)用受到極大限制。
[0035] 本發(fā)明進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)，在所述培養(yǎng)體系中，分別添加0. 2 %牛血清白蛋白 (BSA)、0. 2%無異源成分的血清替代物（KnockOut SR XenoFree)、1%無異源成分的血清替 代物（KnockOut SR XenoFree)，男性來源多能干細(xì)胞培養(yǎng)12天，PLZF陽性類精原干細(xì)胞 比率分別為49.1%、36.0%、51.0%，見圖4。結(jié)果表明，采用1%無異源成分的血清替代物 (KnockOut SR XenoFree)替換常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中的BSA，PLZF陽性類精原干細(xì)胞比率并未受 到影響，且其批次穩(wěn)定、無動(dòng)物源組分，所形成的相關(guān)技術(shù)體系，可在臨床治療中推廣應(yīng)用。
[0036] 現(xiàn)有技術(shù)中飼養(yǎng)層共培養(yǎng)方式已廣泛應(yīng)用于多能干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化技術(shù)領(lǐng) 域。本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明培養(yǎng)體系中撤去飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)12天，獲得PLZF陽性類 精原干細(xì)胞比率顯著增加，由7. 93%提高至55. 4%，見圖5。
[0037] 本發(fā)明特點(diǎn)及有益效果包括：
[0038] 本發(fā)明無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液中含有化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物 (Chemically Defined Lipid Concentrate)、維生素 C等易見光氧化分解、不穩(wěn)定組分，應(yīng) 避光、4°C保存。
[0039] 本發(fā)明培養(yǎng)方法中，當(dāng)男性來源多能干細(xì)胞進(jìn)入所述無血清、無動(dòng)物源性蛋白培 養(yǎng)體系時(shí)，細(xì)胞量應(yīng)達(dá)到培養(yǎng)皿90 %匯合。本發(fā)明克服了由于細(xì)胞密度過低導(dǎo)致后期類精 原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞生成率下降的問題。
[0040] 本發(fā)明培養(yǎng)方法中，進(jìn)入無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)體系時(shí)，1-8天男性來源多 能干細(xì)胞為適應(yīng)期，細(xì)胞死亡量較大，每48小時(shí)換液前，應(yīng)使用無鈣鎂磷酸鹽緩沖液洗滌 一次，去除死細(xì)胞，避免殘留死細(xì)胞對(duì)后期類精原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞產(chǎn)生影響。
[0041] 本發(fā)明培養(yǎng)方法中，無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液的培養(yǎng)期間，每48小時(shí)更換 培養(yǎng)液時(shí)。體外操作時(shí)間過長是導(dǎo)致細(xì)胞層整體卷曲、脫落的主要因素。
[0042] 本發(fā)明從影響多能干細(xì)胞增殖、凋亡因素入手，結(jié)合生殖細(xì)胞分化相關(guān)研宄成果， 通過精心設(shè)計(jì)與方法實(shí)踐，采用無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液的培養(yǎng)技術(shù)，使得男性來源 多能干細(xì)胞體外分化過程中產(chǎn)生類精原干細(xì)胞、單倍體細(xì)胞。本發(fā)明采用無血清、無動(dòng)物源 性蛋白培養(yǎng)方案，培養(yǎng)液中不含動(dòng)物源蛋白、且培養(yǎng)方法中不含飼養(yǎng)層細(xì)胞等其他動(dòng)物組 分，本發(fā)明培養(yǎng)液、培養(yǎng)方法均實(shí)現(xiàn)"無動(dòng)物源組分"以適應(yīng)臨床推廣，為非梗阻性無精子癥 致病機(jī)理（Ν0Α癥病理）機(jī)制研宄及其臨床治療提供了堅(jiān)實(shí)有力的技術(shù)平臺(tái)，拓展了哺乳動(dòng) 物多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生生殖細(xì)胞研宄領(lǐng)域，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
【附圖說明】
[0043] 圖1表示男性來源多能干細(xì)胞接種密度對(duì)后期類精原干細(xì)胞形成率的影響。其 中，圖IA示意30 %細(xì)胞匯合后，圖IB示意90 %細(xì)胞匯合后。
[0044] 圖2表示α -巰基乙醇、維生素 C對(duì)無血清、無動(dòng)物源性蛋白培養(yǎng)液培養(yǎng)期間男性 來源多能干細(xì)胞增殖的影響。其中，圖2Α為實(shí)驗(yàn)結(jié)果照片，圖2Β為MTT分析法實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0045] 圖3表示α -巰基乙醇、維生素 C對(duì)培養(yǎng)12天時(shí)PLZF陽性類精原干細(xì)胞形成率 的影響。其中，圖3Α為流式細(xì)胞儀分析