具有降低的受體介導的清除率的生物活性多肽單體-免疫球蛋白Fc片段綴合物以及制備 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及:包含綴合物的長效藥物組合物，所述綴合物包括連接至免疫球蛋白 Fc片段的生理活性的多膚，其中組合物包含單體綴合物一一其包括連接至單個免疫球蛋白 Fc片段的一分子的生理活性的多膚，并且任選地包含多聚體綴合物一一其包括連接至單個 免疫球蛋白化片段的兩分子或更多分子的相同的生理活性的多膚，條件是組合物中單體綴 合物與多聚體綴合物的摩爾比為至少19;生理活性的多膚單體-免疫球蛋白Fc片段綴合物， 其包括經由非膚基連接體連接至免疫球蛋白化片段的生理活性的多膚單體，其中生理活性 的多膚W單體形式經由非膚基連接體連接至免疫球蛋白Fc片段，該綴合物與二聚體綴合 物一一其包括經由非膚基連接體連接至單個免疫球蛋白化片段的兩分子的生理活性的多 膚，或綴合物一一其包括框內連接至免疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚二聚體一一相 比，顯示了降低的受體介導的內化或受體介導的清除率;和制備該長效藥物組合物的方法。
【背景技術】
[0002] 眾所周知，蛋白質在體內通過多種機制被清除，包括通過血清蛋白酶降解、通過腎 臟消除、或通過受體清除。因此，已經進行了多種嘗試來避免運樣的蛋白質清除機制W增加 生理活性的蛋白質的半衰期，從而增強它們的治療效果。具體而言，為了增加蛋白質的半衰 期，已經對于包括連接至蛋白質的聚乙二醇聚合物(PEG)、白蛋白、脂肪酸或抗體化片段(恒 定區）的蛋白質綴合物進行了研究。運種研究旨在將運種物質共價地連接至生理活性的蛋 白質，從而增加生理活性的蛋白質的血清半衰期并縮短藥物施用的間隔，從而增加患者的 便利。具體而言，為了穩定蛋白質并抑制它們與蛋白酶的接觸和它們通過腎臟的消除，使用 了將高度可溶的聚合物比如PEG化學地附著至蛋白質藥物的表面的方法。在運種方法的情 況下，眾所周知，聚合物非特異性地結合至祀蛋白的特異性位點或各個位點來增加蛋白質 的溶解度，穩定蛋白質并阻止蛋白質的水解，并且進一步地，不引起具體的副作用(Sada等， JJermen^tion Bioengineering 71:137-139,1991)。然而，運種方法存在一些問題，因為 即使連接至生理活性的蛋白質的PEG可W增加蛋白質的穩定性，但是它顯著降低了蛋白質 的效價，并且隨著PEG分子量增加，其與蛋白質的反應性降低，導致產量降低。此外，當蛋白 質的特定氨基酸殘基利用脂肪酸進行修飾時，修飾的脂肪酸可逆地結合至血清白蛋白W增 加蛋白質的血清半衰期，但是半衰期為大約1天至1周，運表明半衰期的增加不是非常顯著 的。此外，存在缺點，因為與白蛋白可逆地解離的生理活性的蛋白質輕易地通過腎臟被消 除。
[0003] 由于運些原因，已經進行了努力W使用免疫球蛋白片段來增加包括蛋白質在內的 生理活性物質的半衰期。具體而言，已經積極地進行了研究W通過將治療性蛋白質與運種 免疫球蛋白Fc片段融合來增加治療性蛋白質的穩定性。
[0004] 在哺乳動物中通過基因重組方法將干擾素（韓國專利特開公布號2003-9464)、白 介素-4受體、白介素-7受體或紅細胞生成素受體(韓國專利號249572)作為與免疫球蛋白Fc 片段的融合進行表達是已知的。而且，國際專利公布號WO 01/03737公開了融合蛋白，其包 括經由寡膚連接體連接至免疫球蛋白化片段的細胞因子或生長因子。而且，美國專利號5， 116,964公開了融合蛋白，其包括通過基因重組方法融合至免疫球蛋白化片段的氨基或簇 基末端的L皿(淋己細胞表面糖蛋白）或CD4蛋白，并且美國專利號5,349,053公開了比-2與 免疫球蛋白化片段的融合蛋白。此外，通過基因重組方法制備的Fc融合蛋白的實例包括干 擾素-e或其衍生物與免疫球蛋白化片段的融合蛋白（國際專利公布號WO 00/23472)、化-5 受體與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白（美國專利號5，712,121)、干擾素 -a與免疫球蛋白 G仲C片段的融合蛋白（美國專利號5,723,125)和CD4蛋白與免疫球蛋白G2化片段的融合蛋 白（美國專利號6,451，313)。此外，美國專利號5,605,690設及對免疫球蛋白化片段中的氨 基酸殘基進行修飾并公開了使用通過修飾免疫球蛋白化片段中具體的補體結合位點或受 體結合位點的氨基酸殘基獲得的化片段通過基因重組方法制備的TNFR-IgGl化融合蛋白。 而且，使用如上所述修飾的免疫球蛋白Fc區通過基因重組方法制備融合蛋白的方法也在美 國專利號6,277,375、6,410,008和6,444,792中公開。但是，具有與其融合的免疫球蛋白化 片段的生物藥需要克服由Fc片段固有的效應子功能引起的細胞毒性問題。
【發明內容】
[000引技術問題
[0006] 本發明人已經進行了大量的努力來制備具有免疫球蛋白化片段到生理活性的多 膚造成的增加的血清體內半衰期的綴合物。結果，本發明人已經發現，當生理活性的多膚W 單體形式連接至免疫球蛋白化片段時，與當生理活性的多膚W多聚體形式存在時相比，甚 至在大鼠動物模型中，它顯示了顯著降低的受體介導的清除率并且還顯示了長的半衰期， 從而完成本發明。
[0007] 技術方案
[000引本發明的目標是提供包含綴合物的長效藥物組合物，所述綴合物包括連接至免疫 球蛋白化片段的生理活性的多膚，其中組合物包含單體綴合物一-其包括連接至單個免疫 球蛋白化片段的一分子的生理活性的多膚，并且任選地包含多聚體綴合物一-其包括連接 至單個免疫球蛋白化片段的兩分子或更多分子的相同的生理活性的多膚，條件是組合物中 單體綴合物與多聚體綴合物的摩爾比為至少19。
[0009] 本發明的另一目標是提供生理活性的多膚單體-免疫球蛋白Fc片段綴合物，其包 括經由非膚基連接體連接至免疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚單體，其中生理活性的多 膚W單體形式經由非膚基連接體連接至免疫球蛋白化片段，該綴合物與包括框內連接至免 疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚的綴合物相比，顯示了降低的受體介導的內化或受體介 導的清除率。
[0010] 本發明的仍另一目標是提供制備長效藥物組合物的方法，該方法包括：（a)將生理 活性的多膚連接至免疫球蛋白化片段W制備生理活性的多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的 混合物;和(b)自該混合物分離生理活性的多膚單體-免疫球蛋白化片段綴合物，該生理活 性的多膚單體-免疫球蛋白化片段綴合物包括連接至單個免疫球蛋白Fc片段的一分子的生 理活性的多膚。
[0011] 有益效果
[0012] 如上所述，本發明的綴合物一-其包括連接至免疫球蛋白化綴合物的生理活性的 多膚單體一-顯示了顯著降低的受體介導的內化或受體介導的清除率，并且因此具有增加 的血清半衰期。因此，本發明的綴合物可W提供具有增加的血清半衰期和治療優越性的藥 物。
【附圖說明】
[0013] 圖1示意性地顯示了生理活性的多膚單體-Fc綴合物的代表性結構（圖1A)和生理 活性的多膚二聚體-Fc綴合物的最主要構型（圖1B)。
[0014] 圖2顯示了化P-I激動劑-免疫球蛋白化片段綴合物(本發明的實施例）和化P-I激 動劑-免疫球蛋白Fc片段融合蛋白--其中化P-I激動劑W二聚體形式存在（比較實施 例)一-之間的受體內化程度的比較。
[001引圖3顯示了本發明的實施例的化P-I激動劑綴合物和比較實施例的化P-I激動劑綴 合物之間的體內藥代動力學的比較。
[0016] 最佳模式
[0017] 為了實現上述目標，在一方面，本發明提供了包含綴合物的長效藥物組合物，所述 綴合物包括連接至免疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚，其中組合物包含單體綴合物一一 其包括連接至單個免疫球蛋白Fc片段的一分子的生理活性的多膚，并且任選地包含多聚體 綴合物一一其包括連接至單個免疫球蛋白化片段的兩分子或更多分子的相同的生理活性 的多膚，條件是組合物中單體綴合物與多聚體綴合物的摩爾比為至少19。
[001引在一個實施方式中，長效藥物組合物中包含的綴合物可包括插入生理活性的多膚 和免疫球蛋白Fc片段之間W將生理活性的多膚連接至免疫球蛋白Fc片段的非膚基連接體。
[0019] 在另一個實施方式中，與二聚體綴合物一一其包括經由非膚基連接體連接至單個 免疫球蛋白化片段的兩分子的生理活性的多膚，或綴合物一一其包括框內連接至免疫球蛋 白Fc片段的生理活性的多膚二聚體一一相比，單體綴合物可顯示降低的受體介導的內化或 受體介導的清除率。
[0020] 在又另一個實施方式中，生理活性的多膚可選自膜高血糖素樣膚-l(GLP-l)、粒細 胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素化GH)、紅細胞生成素化P0)、膜高血糖素、胃泌酸調節 素、膜島素、生長激素釋放激素、生長激素釋放膚、干擾素、干擾素受體、G-蛋白-偶聯受體、 白介素、白介素受體、酶、白介素結合蛋白、細胞因子結合蛋白、巨隧細胞活化因子、巨隧細 胞膚、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋己毒素、月中 瘤壞死因子、腫瘤抑制素、轉移生長因子、曰-1抗膜蛋白酶、白蛋白、a-乳白蛋白、載脂蛋白-E、高度糖基化的紅細胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體活化膚、血栓調 節蛋白、血液因子￥11、￥11曰、￥111、^和乂111、纖維蛋白溶酶原活化因子、纖維蛋白-結合膚、 尿激酶、鏈激酶、水賠素、蛋白C、C-反應蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、 瘦蛋白、血小板衍生的生長因子、上皮生長因子、表