[0111] 分析依照本發明的原理制成的反應樣品（即，實施例2A或2B)以評估溫育期間這些 混合物中的化學組分如何變化。利用標準方法，通過液相色譜-高分辨率質譜(LC-HRMS)進 行植物化學分析，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)評估蛋白質/肽組合物。
[0112] 在第2階段發酵反應中溫育0小時(起始材料)至72小時之后，充分混合樣品并利用 乙醇提取一份（1.0-1.5g)。對于依照實施例2B的溫育，在時間0之后向起始材料DE5和DE7 (分別含或不含蜂蠟的實施例2A)中加入菠蘿粉。使用反相超高效液相色譜(RP-UHPLC)和負 離子電噴霧電離(ESI)通過LC-MS分析產生的提取物。
[0113] 在圖5中，所檢測樣品如下：
[0114] DE2:提取物樣品2A，不含蜂蠟，72小時
[0115] DE3:提取物樣品2A，72小時
[0116] DE4:提取物樣品2B，不含蜂蠟，24小時
[0117] DE5:提取物樣品2A，0小時(起始材料-第1階段）
[0118] DE6:提取物樣品2B，24小時
[0119] DE7:提取物樣品2A，不含蜂蠟，0小時(起始材料-第1階段）
[0120] DE8:提取物樣品2B，不含蜂蠟，72小時
[0121] DE9:提取物樣品2B，72小時
[0122] 使用12.5%的還原性SDS-PAGE凝膠。標記為Biorad#161-0373，染色劑類型 ：All Blue(Bi〇-Rad Lab·,Hercules,California)〇
[0123] -般而言，圖5顯示:作為2階段方法的一部分，分子量較大的蛋白質被降解或消化 成分子量較小的蛋白質組分。
[0124] 樣品DE5和DE7是2階段方法的（第1階段)起始材料，其顯示：樣品中大量蛋白質具 有高分子量(>250kD)_如此多以至于它們中的許多不進入凝膠。樣品DE2和DE3在50-75kD之 間顯示出顯著的條帶(其還以較低的量存在于剩余樣品中）。在約25kD處的另一條帶出現在 樣品DE4、DE6和DE8中，并以較低的程度出現在DE9中。
[0125] 樣品DE4、DE6和DE8在分子量小于15kD處顯示出顯著染色。樣品DE2、DE3和DE9在該 范圍內以較低的程度顯示蛋白質/肽。
[0126] 因此，相較于起始材料(DE5和DE7 )，溫育樣品中的蛋白質隨時間的大小分布明顯 較小，無論含或不含菠蘿粉酶、或者含或不含蜂蠟。
[0127] 在圖6中，觀察第2階段溫育的進程并分析反應產物。所檢測樣品如下：
[0128] DE5:提取物樣品2A，0小時(起始材料-第1階段），如上所述
[0129] DE6'：提取物樣品2A，24小時 [0130] DE9'：提取物樣品2A，48小時
[0131] DElT :提取物樣品2A，72小時
[0132] 第2階段發酵反應的進程顯示了被確定為二咖啡酰基奎寧酸異構物和被認為是二 咖啡酰基酒石酸酯或醚化合物的化合物的模式。如圖6中所示，72小時之后，觀察到形成了 酚類化合物二咖啡酰基奎寧酸的多種異構物，其是第2階段反應的指示物或標記。認為也形 成了多種二咖啡酰基酒石酸酯或醚異構物（例如，咖啡酰基部分的四甲基醚）。這些樣品顯 示出含有大量咖啡酰基奎寧酸異構物和被認為的二咖啡酰基酒石酸酯或醚化合物（即，菊 苣酸衍生物，包括甲基醚或酯）。
[0?33]因此，雖然不想被理論束縛，但肽在根據"親脂化（I ipophi I ization)"或"脂化 (lipolyzation)"方法的2階段方法中產生，其中蛋白質被消化、酚類化合物被異構化或甲 基化，且脂肪酸可參與酯化反應以產生有用和有益的新產品。在另一個實施方式中，預期可 連同脂肪酸發生類黃酮的羥基化和/或乙酰化。在另一個實施方式中，預期在2階段發酵反 應期間可發生單寧的水解或配基的糖基化。在又一個實施方式中，預期在2階段發酵反應期 間可發生脂肪酸的羥基化。實際上，通過HPLC分析觀察到：2階段反應產物的液體組合物產 生了提高的脂質含量。
[0134] 如下所述生產潤滑乳膏。
[0135] 實施例3(實驗水性乳膏制劑）
[0137] 不添加提取物的水性乳膏被用作安慰劑，因此前提是：添加提取物必須比作為目 前的非留族抗濕疹治療的水性乳膏在臨床上顯著更好。
[0138] 相應地，在一些人類志愿者中，使用對羥基苯甲酸酯類顯著抑制了提取物的功效。 在一些人類志愿者中，苯氧乙醇未完全抑制但仍然降低了提取物的功效，這被假定為是由 于殺菌性能。利用對羥基苯甲酸甲酯時發現了類似于對羥基苯甲酸酯類的結果，即提取物 的功效顯著降低。
[0139] 接下來，使用Geogard 221制備一批水性乳膏，Geogard 221作為替代苯氧乙醇和/ 或對羥基苯甲酸酯類的抑菌防腐劑，其包含8%的去水醋酸和87%的芐醇（可獲自Lonza， Allendale ,New Jersey)。當在一些人類志愿者中檢驗時，該制劑提供提取物的全部功效。 因此，發現了防腐劑的類型是重要的，可認為是具有更多"天然產物"相似性的添加劑。
[0140]實施例4(天然基乳膏制劑）
[0142] ^Cetomacrogol 1000, 一種PEG 聚合物
[0143] **Geogard 221
[0144] 因此，發現了非常穩定且不使用殺菌防腐劑的有用的水性乳膏制劑。這種物質是 可被涂在人類皮膚上的漂亮軟膏。
[0145] 向實施例4的基礎乳膏中加入基于制劑的總重量量為5重量％的實施例2A的2階段 提取物。基于制劑的總重量，2階段提取物的可用量可以為約0.5重量％至約10重量％。基于 制劑的總重量，2階段提取物的優選范圍可以為約0.5重量％至約5重量％。
[0146] 此外，向實施例4的基礎乳膏中加入精油或香料，其中基于制劑的總重量，柑橘油 提取物的加入量為0.4重量％。基于制劑的總重量，一種或多種精油的可用量可以為約0.4 重量％至約1重量％。
[0147] 實施例5(檢驗包含實施例2A提取物的基礎乳膏）
[0148] 利用人類志愿者，如下所述檢驗包含5重量％實施例2A提取物和0.4重量％柑橘油 提取物的實施例4的基礎乳膏(表1)。
[0149] 表1
[0150]
[0151] 如表1中所示，這種制劑清除了志愿者上的濕疹和牛皮癬。受試者1、3、4、5、8、9和 10有一周不使用乳膏，然后試用為臨床試驗準備的實施例6的乳膏（以下），與實施例4具有 等效結果。
[0152] 實施例6A(皮膚乳膏制劑）
[0153] 如下所述制備皮膚乳膏制劑。
[0154]
[0155] **Geogard 221
[0156] Olivem 1000可獲自B&T Srl(Milan，意大利），其是用于水包油乳膏和洗劑的來源 于橄欖油的非離子、未乙氧基化的自乳化體系。
[0157] 在如實施例5的人類志愿者中使用實施例6A的初始試驗給出了關于濕疹和牛皮癬 等的類似結果。
[0158] 實施例6B(皮膚乳膏制劑）
[0159] 在另一個實施方式中，制備皮膚乳膏制劑。
[0160]
[0161] 1脂化的脂肪酸和肽，如本文所述的圖I、2和5中所示。
[0162] 最終的制劑是灰白色的粘性乳膏，pH 4.0-5.0。微生物學性質：需氧平板計數：（30 °C)377cfu/g;酵母和霉菌:〈lcfu/g。可用手將乳膏局部施加在人類皮膚表面。
[0163] 在一個實施方式中，可使用約1重量％至約10重量％的2階段提取物。在另一個實 施方式中，可使用約70重量％至約90重量％的水。增加水含量和/或替代性地增加第1階段 中的椰子水含量(如上所述)可降低制造成本。
[0164] 如下所述在臨床試驗中檢驗實施例6B的乳膏制劑。
[0165] 實施例6C(臨床研究-濕疹）
[0166] 該研究的目的是確定實施例6B在治療輕至中度濕疹中的效果，包括減少病變出 現、減少瘙癢和起鱗(seal ing)的癥狀、以及減少泛紅。
[0167] 臨床研究設計
[0168] 該研究被設計為開放標簽、適應性設計的預備研究。
[0169] 研究中包括在其他方面均健康的具有輕至中度濕疹的18-70歲的受試者。篩選總 共η = 40個受試者，且從中η = 21個被隨機化;但僅η = 20個受試者完成了研究。使用其它標 準錄入/排出標準。監測不良事件。MaGil IRB(Rockville，MD)授予了方案的最初IRB批準。 所有招募材料在使用之前均經IRB批準。
[0170] 對于每個受試者，研究持續時間長達5周，包括5次訪視，其中試驗期為30天（約4 周)。
[0171] VI:篩選訪視一7天
[0172] V2:第0天-基線
[0173] V3:第7 天
[0174] V4:第 15 天
[0175] V5:第30天-研究結束
[0176] 受試者被要求經受任何和所有濕疹治療的7天的洗去。
[0177] 皮膚病學評估。由有資格的從業者進行皮膚病學檢查。這種評估包括異位性皮炎 嚴重度得分(SCORAD)，其是對病變性質的評價和分級。受試者完成了皮膚病生活質量指數 (DLQI )，其是對每個受試者自身皮膚狀況的自我評估。
[0178]照片。為受試者拍照以檢查和評價皮膚病變，所述皮膚病變用解剖學位置和尺寸 來鑒定。
[0179] 分配程序。在該次訪視時，分配如下：
[0180] 給予受試者供應一周的研究產品（實施例6B的乳膏）并指示每天涂抹2次。給予受 試者每日給藥日志。
[0181] 指示:指示患者每日2次將乳膏局部施加在受影響的區域。也就是說，指示具有濕 疹的患者每日2次將乳膏局部施加在給定的病變處。
[0182]劑量:基于本文所示的臨床試驗，每個患者每天使用平均2.46g實施例6B的乳膏。 每處病變使用平均1.52g實施例6B的乳膏。
[0183] 數據分析。使用Social Sciences的統計軟件(SPSS版本19)運行所有終點的所有 描述性和推演性分析。
[0184] 首要目標是通過檢查皮膚病變照片（圖7A-7B和8A-8B)來評估病變出現的減少。第 二個目標是通過不同的皮膚病學評估來評估瘙癢、起鱗和泛紅癥狀的減少，如表1A中所示。
[0185] 表1A
[0186]
[0187] 瘙癢、起鱗和泛紅的視覺模擬量表(VAS)癥狀得分。還要求受試者經受對濕疹皮膚 病變的瘙癢、起鱗和泛紅的皮膚病學評估。分析顯示瘙癢、起鱗和泛紅的平均VAS癥狀得分 從第1周至第2、3和4周顯著降低(對于所有時間點，P-值<0.05)。
[0188] 根據表1A，第1周至第4周，瘙癢(VAS)癥狀得分由基線降低為-30.27%。
[0189] 根據表1A，第1周至第4周，起鱗(VAS)癥狀得分由基線降低為-30.53%。
[0190] 根據表1A，第1周至第4周，泛紅(VAS)癥狀得分由基線降低為-33.95%。
[0191] 已發現:從基線至第30天，濕疹的嚴重度具有統計學顯著變化(P-值<0.05)。總體 上，中度濕疹被報告為嚴重度降低且19.44%的病變在第30天時已消失。注意到：大多數中 度至重度病變也減少(基于病變計數，和輕度、中度或重度類型的評估）。參見表1A。
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