用于制備與蜂蠟組合的基于花粉的物質的反應平臺和方法及其用圖
【專利說明】用于制備與蜂蠟組合的基于花粉的物質的反應平臺和方法及 其用途 發明領域
[0001]描述了用于制造基于花粉的產品的方法以及反應平臺。描述了適合施用給個體的 化妝和營養制劑，其包含與蜂蠟組合的基于花粉的物質，包括多肽、氨基酸、脂肪酸甘油三 酯和類黃酮。
[0002] 背景
[0003] 自然狀態下的蜂巢包含有趣的化學，包括通過某些酶的作用釋放有價值的被運輸 至蜂巢的花粉的生物活性組分。然而，使用蜂巢原料或混合物存在問題，包括組分分離、微 生物菌群污染、和/或暴露于用來消滅害蟲(例如螨蟲）的殺蟲劑。因此，需要一種使用協同 組合的期望蜂巢組分有效利用(economize)已流水線化的生產的方法。
[0004] 本發明人(Weir，曾用名O'Brien)已證實:植物具備內部遺傳機制以控制凋亡（又 名程序性細胞死亡(PCD))的過程和進展。在一個實例中，染色體凝聚(其是哺乳動物細胞中 PCD的標志）在植物細胞中在凋亡早期階段可以是可逆的（O'Brien等人，The Plant Journal(1998)13(6):803-814)。
[0005] 花粉具有被稱為孢粉素的硬殼，孢粉素非常耐化學降解。此外，花粉表面上有引起 已知變態反應的蛋白。在一種方法中，利用反應使花粉粒在壓力下"爆炸"或"破裂"，隨后使 用蛋白酶來使產生變態反應的蛋白水解和失活。
[0006] 在另一種可行的兩步反應中，可操作花粉使起始萌發并因此更溫和和天然地釋放 花粉的生物活性內容物。
[0007] 因此，如果能夠找到一種方法首先打開花粉粒或使花粉粒萌發從而以生物方式釋 放有益組分，隨后加入其它蜂巢組分，那么這將模擬天然過程，從而提供獲得營養品或化妝 品的新方法。
[0008] 異位性皮炎(通常被稱為濕疹)是復雜的皮膚疾病，其特征為瘙癢、受損的表皮屏 障功能、以及對多種食物和環境變應原的免疫球蛋白致敏（Sohn，A.等人，"Eczema，" Mt.Sinai J.Med. (2011)78:730-739)。皮膚炎癥表現得類似紅斑，其可包括起鱗(scaling) 和痂（Krafchik，B.R.，"Eczema,"Paediatr.Child Health(2000)5:101-105)。其通常由于 基因與環境的相互作用而發生。有濕疹的患者發展出更高的皮膚感染風險。護膚品(包括保 濕乳膏）被用于處理干燥和鱗狀的皮膚（Loden，M.等人，"A double-blind study comparing the effect of glycerine and urea on dry，eczematous skin in atopic patients，" Acta Derm. Venereol · (2002)82:45-47)。這種乳膏（cream)的效果表明 了對嘗 試所述產品的患者的生活質量有積極影響(Eberlein，B.等人，"Adjuvant treatment of atopic eczema:assessment of an emollient containing N-paImitoyIethanolamine (ATOPA study)，"J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol·(2008)22:73-82)〇
[0009] 如果能夠找到一種方法來使用基于植物的物質以影響或控制哺乳動物細胞中的 免疫或P⑶信號通路，這將為營養和醫學領域做出有價值的貢獻。
[0010] 此外，如果能夠找到一種方法來使用基于植物的物質(包括基于花粉的提取物）以 處理炎性或皮膚狀況(conditions)，這將為營養、化妝和醫學領域做出有價值的貢獻。
[0011] 發明概述
[0012] 基于花粉的提取物包含萌發的花粉、蜂巢組分、和任選地含酶物質(包括蜜露或植 物粉)。
[0013]水性皮膚乳膏(aqueous skin cream)包含基于花粉的提取物和甘油、天然油、潤 滑劑、防腐劑、維生素、香料、乳化劑或蠟中的一種或多種。皮膚乳膏可被用于處理皮膚狀況 或炎癥。
[0014] 提供治療濕疹或牛皮癬的方法，所述方法包括：向需要這種治療的個體施用治療 有效量的水性皮膚乳膏。所述皮膚乳膏可局部(topically)施用至皮膚。
[0015] 提供用于生產基于花粉的提取物物質的兩階段反應平臺，所述反應平臺包括以下 步驟:第一階段，其包括:使花粉粒打開和/或萌發，使經處理的花粉粒與一種或多種蜂巢組 分反應，所述蜂巢組分選自蜂蠟、蜂蜜或含酶物質，以及攪拌以形成膠狀物;和第二階段，其 包括:在密閉容器中加熱所述膠狀物以產生提取物。所述提取物可以是發酵的提取物。應該 理解，可通過加入一種或多種組分使提取物進一步可發酵。 附圖簡介
[0016] 圖1描述了根據本發明的一個實施方式制備的打開和發酵的花粉的脂肪酸分析。
[0017] 圖2描述了根據本發明的一個實施方式制備的打開和發酵的花粉(來自反應的上 層和沉降物二者)的脂肪酸分析。
[0018] 圖3A描述了在MTT試驗中用具有非常強的細胞保護活性的基于椰子水的提取物 (作為未發酵的"7K"提取物)處理HL-60細胞。
[0019] 圖3B描述了在MTT試驗中用具有非常強的細胞保護活性并促進細胞增殖的基于椰 子水的提取物(作為發酵的2階段"乙醇"提取物)處理HL-60細胞。
[0020] 圖4描述了在MTT試驗中用包含具有非常強的細胞保護活性的樹番茄粉并促進細 胞增殖的基于椰子水的提取物(作為發酵的2階段"乙醇"提取物)處理HL-60細胞。
[0021] 圖5描述了根據本發明的一個實施方式制備的打開和發酵的花粉的凝膠電泳 (SDS-PAGE)分析。泳道標記如下：DE2-DE9 (12.5μ1上樣）、蛋白標記、和DE2-DE7 (2.5μ1)上 樣，如下所述。
[0022]圖6描述了根據本發明的一個實施方式制備的打開和發酵的花粉的RP-UHPLC和陰 離子電噴霧電離(ESI)分析(實施例2Α)，其顯示了長達72小時的2階段發酵反應的產物。 [0023]圖7A顯示了：處理之前，具有嚴重濕疹的人類患者的一只手的照片。
[0024]圖7B顯示了 ：使用實施例6B的發酵的基于花粉的乳膏局部處理4周后，圖7A的濕疹 患者的照片。
[0025]圖8A顯示了：處理之前，具有嚴重濕疹的人類患者的一條胳膊的照片。
[0026]圖8B顯示了 ：使用實施例6B的發酵的基于花粉的乳膏局部處理4周后，圖8A的濕疹 患者的照片。
[0027]圖9A顯示了：處理之前，具有牛皮癬病變的人類患者的一條腿的照片。
[0028]圖9B顯示了 ：使用實施例6D的發酵的基于花粉的乳膏局部處理4周后，圖9A的牛皮 癬患者的照片。
[0029]圖10描述的柱狀圖顯示了 ：接受含有根據本發明的一個實施方式制備的發酵的基 于花粉的提取物的皮膚乳膏（實施例6B)的臨床處理組(n = 20)的異位性皮炎嚴重度得分 (SCORAD)指數。
[0030]圖11描述的柱狀圖顯示了 ：接受含有根據本發明的一個實施方式制備的發酵的基 于花粉的提取物的皮膚乳膏（實施例6B)的臨床處理組（n = 20)的皮膚病生活質量指數 (DLQI)0
[0031] 詳細描述
[0032] 在下文中，連同闡釋本發明原理的附表和附圖一起提供了本發明的一個或多個實 施方式的詳細描述。因而，該詳細描述通過示例性方式而非限制性方式闡釋了本發明。該描 述能夠清楚地使本領域技術人員能夠實施和使用本發明，并且描述了本發明的若干實施方 式、改變、變化、替代方式和用途，包括目前我們認為本發明的最佳實施方式。應當清楚地理 解:可對所述發明進行常規的變化和改變，且這種變化和改變明確落入本發明的精神和范 圍內。
[0033] 換言之，結合這些實施方式描述本發明，但本發明不限于任何實施方式。本發明的 范圍僅由權利要求限定且本發明包含多種替代方式、修改和等同。以下描述中給出了多個 特定細節以提供對本發明的透徹理解。這些細節被提供用于示例的目的，可根據權利要求 且利用或不利用這些特定細節中的一些或全部來實現本發明。
[0034] 已提供了安全有效的基于花粉的皮膚乳膏，其包含蜂蠟和任選地酶，其可以以治 療有效量被施用至個體用于治療濕疹或牛皮癬。基于花粉的皮膚乳膏可局部施加在皮膚 上。
[0035] 花粉具有被稱為孢粉素的硬殼，孢粉素非常耐化學降解。此外，花粉表面上有引起 已知變態反應的蛋白。在一種方法中，利用反應使花粉粒在壓力下"爆炸"或"破裂"（常用的 非生物方法），隨后使用蛋白酶來使產生變態反應的蛋白水解和失活。任選地，然后可使用 肽酶由產生的混合物或湯(soup)中產生肽。
[0036] 不同于試著使花粉粒爆炸(其的確有部分作用），嘗試操作或處理花粉粒以起始萌 發并因此天然地釋放它們的內容物，從而優化生物活性并提供定向性強得多的產品。這可 以被認為是打開花粉的"生物"方法。如果花粉粒爆炸，則所釋放的化合物更響應于壓力(這 對一些醫療狀況有益），但如果它們通過萌發溫和釋放，則它們促進細胞更新和修復（如之 前所討論的）。通過利用生物萌發途徑，有活力的花粉粒開始萌發而受損或死亡的花粉粒保 留并可被濾出。因此，通過除去死亡的花粉粒，這種途徑也是一種改善。
[0037]在一個實施方式中，已發現兩步法可被用于生產基于花粉的提取物物質，所述方 法包括利用生物方法使花粉粒打開和/或萌發，和使經處理的花粉粒與一種或多種蜂巢組 分(例如，蜂錯、蜂膠(propolis)等)反應。
[0038] 發酵方法的開發和花粉粒的打開。
[0039] 首先，在密封的不銹鋼瓶內，在水(500mL)中將少量干花粉(25g)與白糖(5g)和活 性酵母(5g)混合。在環境溫度下，約72小時后，所產生的這種混合物發酵并產生醇和伴隨的 醇氣味。
[0040]利用來自新西蘭南部(Nothofagus spp.)山毛櫸森林中的山毛櫸樹的蜜露（分離 自新西蘭山毛櫸蟻殼蟲Ultracoelostoma assimiIe(Maskel 1))和原蜜（馬努卡，忍冬花，三 葉草)進行之后的實驗。在新西蘭內，這種昆蟲主要出現在南島且在黑山毛櫸(N.solandri solandri)和山地山毛櫸(N. s . cliffortioides)上最常見，但通常任何山毛櫸都能滿足 (Gaze等人，N.Z.J.Ecol. (1983)6:33-37)。在這些實驗中，發酵反應在較高溫度(37°C、42°C 或65°C)下在約24小時內發生，但在25°C下則耗費48小時。顯示出約66 %的花粉粒打開。此 外，使用蜜露不產生醇氣味，但會產生非常金黃色的油質湯。
[0041]發酵和花粉粒打開之后進行脂肪酸（FA)含量分析，如圖1和2中所示（NZLabs， Auckland，新西蘭）。示例性的發酵后沉降物的過濾請參見下文的制備實施例A和B。
[0042] FA分析結果清楚顯示:在打開的花粉粒中，脂肪酸含量被保持和保護。該實驗所證 明的關鍵事情在于：脂肪酸從花粉中釋放，但在未爆炸的花粉中，所分析的湯中沒有脂肪 酸。
[0043]反應平臺的開發
[0044]發現了有效打開花粉粒的方法后，進行了花粉粒內容物和來自蜂巢的其它組分 (例如，蜂蠟、蜂膠等)的反應。通過如下所述的一些制備實施例開發了方法。
[0045] 已發現:包含昆蟲酶的蜜露(來自南方山毛櫸森林）比原蜜效果好。蜜露是由山毛 櫸樹上的食用汁液的蚧殼蟲提煉的物質。這種蜜露是蜂蜜物質，但含有來自蚧殼蟲的酶和 它們的"腸道菌群，包括嗜果糖(fructo