20°C下加熱過夜，HPLC純 化之后，得到17mg(20%)標題化合物。 古-醒R(DMS0-d6): 5 =0.43-0. 50 (2H), 0.59-0. 68 (2H), 2.11 (3H), 2.77 (1H), 3. 35(1H), 3. 61(2H), 3. 83(3H), 4. 34(2H), 4. 63 (2H), 6. 09(1H), 7. 02-7. 09 (IH), 7. 13-7. 25 (2H), 7.30(1H), 7. 61-7. 68 (IH), 7.77(1H), 7.83(1H), 7.91(1H), 8. 22 (IH)ppm。
[014引中間體連施例26a 4-{6-漠-8-[(氧雜環下燒-3-基甲基）氨基]咪挫并[l，2-b]化嗦-3-基}-N-環丙 基-2-甲基苯甲酯胺
向3000mg(6677帕ol)按照中間體實施例2化制備的4-[6-漠-8-(甲橫酷基）咪 挫并[1，2-b]化嗦-3-基]-N-環丙基-2-甲基苯甲酯胺的150mlTHF懸浮液中加入873 mg(l〇〇2帕〇1)1-(氧雜環下燒-3-基）甲胺和2589mg(2003帕oDDIPEA，并將該混合物 在60°C下加熱72小時。進一步加入100mg的1-(氧雜環下燒-3-基）甲胺并在60°C加 熱8小時之后，真空除去溶劑，將殘余物吸收在乙酸乙醋中，并用水洗涂。濾出所形成的沉 淀，得到0.99g(33%)標題化合物。將剩余的水相用DCM再萃取，并將合并的有機相蒸發。 在75°C，將殘余物與THF-起研磨，另外得到1. 65g(53%)標題化合物。 iH-NMR(DMS0-d6): 5 =0.46-0. 53(2H), 0.61-0. 69(2H), 2. 35(3H), 2. 75-2. 85(1H), 3. 25(1H), 3. 54-3. 69 (2H), 4. 31(2H), 4. 62 (2H), 6. 45(1H), 7. 36(1H), 7. 84(1H), 7. 90(1H), 7. 94(1H), 8. 12(1H), 8. 30(lH)ppm〇 陽14引 中間體連施倆I2化 4-[6-漠-8-(甲橫酷基）咪挫并[l，2-b]化嗦-3-基]-N-環丙基-2-甲基苯甲酯胺
向12. 5g(28. 75mmoU按照中間體實施例26c制備的4-[6-漠-8-(甲硫 基）咪挫并[1，2-b]化嗦-3-基]-N-環丙基-2-甲基苯甲酯胺的400mlDMF溶 液中加入53.03g(86.26mmol)硫酸氨鐘硫酸鹽（過氧氨橫酷基）氧化物(負離子） ((hy化operoxysulfonyDoxidanide)巧：1:1:2)，并將該混合物在室溫下攬拌過夜，將水溶 液后處理之后，得到8. 6g(60%)標題化合物（雜質是4-[6-漠-8-(甲基亞橫酷基）咪挫 并[l，2-b]化嗦-3-基]-N-環丙基-2-甲基苯甲酯胺）。 UPLC-MS:RT=0. 98min;m/z(ES+)450. 3[MH+];理論值MW=449. 3。 陽144] 中間體連施倆I26c 4-[6-漠-8-(甲硫基）咪挫并[l，2-b]化嗦-3-基]-N-環丙基-2-甲基苯甲酯胺
將包含55. 69g(150mmol)按照中間體實施例26d制備的6-漠-3-艦代-8-(甲硫 基）咪挫并[l，2-b]化嗦、68g(225mmol)按照中間體實施例26g制備的N-環丙基-2-甲 基-4-(4,4, 5, 5-四甲基-1,3, 2-二氧雜棚雜環戊燒-2-基）苯甲酯胺、11g(15mmol) (1，1-二（二苯基麟基）二茂鐵）-二氯鈕（II)、450mlIM碳酸鐘水溶液和632ml四氨 巧喃的混合物在60°C下攬拌12小時，將水溶液后處理之后，得到130g粗品。將殘余物與 DCM-起研磨，得到15. 15g(24%)標題化合物。色譜純化濾液，另外得到2. 65g(3%)標題化 合物。 古-醒R(DMS0-d6): 5 =0.47-0. 54 (2H), 0.62-0. 71 (2H), 2.36 (3H), 2.63 (3H), 2. 77-2. 85 (1H), 7.17 (1H), 7.40 (1H), 7.85 (1H), 7.90 (1H), 8.12 (1H), 8.31 (1H)ppm。 。"引 中間體連施例26d 6-漠-3-艦代-8-(甲硫基）咪挫并[1，2-b]化嗦
向按照中間體實施例26e制備的174g(432mmol) 6, 8-二漠-3-艦代咪挫并[1，2-b] 化嗦的3. 8升二嗯燒溶液中加入30.28g(432mmol)甲硫醇鋼，并將該混合物在60°C下攬 拌5天。進一步加入25g甲硫醇鋼，并將該混合物在80°C下攬拌2小時。冷卻后，將該溶 液傾倒在4升水上，并將水相用乙酸乙醋提取。用水洗涂有機相，用硫酸鋼干燥，過濾，蒸 發，得到102g(64%)標題化合物。 'H-NMR(DMS0-d6):δ=6. 79(1Η), 7. 67(1Η)ppm〇 陽14引 中間體連施倆I26e 6, 8-二漠-3-艦代咪挫并[1，2-b]化嗦
向包含156g巧63mmol)按照中間體實施例26f制備的6, 8-二漠咪挫并[1，2-b]化 嗦、190g(1637mmol)N-艦代班巧酷亞胺和1.3升氯仿的混合物中加入5. 5ml濃肥1，并 將該懸浮液在70°C下加熱過夜。濾出沉淀，并與二異丙基酸一起研磨，得到119g(52%)標 題化合物。 'H-NMR(DMS0-d6):δ=7. 92(1Η),8. 00(1Η)ppm〇 陽147] 中間體連施例26f 6.8- 二漠咪挫并[1，2-6]化嗦
將包含235g巧31mmol)按照中間體實施例26g制備的4, 6-二漠化嗦-3-胺、421ml(2792mmol) 2-漠-1，1-二乙氧基乙燒、2. 93升水和227mlTHF的混合物在125°C下加 熱1小時，并在室溫下過夜。加入固體NaHC〇3,中和該溶液，濾出沉淀，用水洗涂，干燥，得到 156g(80%)標題化合物的淡褐色固體。 'H-NMR(DMS0-d6) : 5=7. 81(1H),8. 40(lH)ppm〇 。"引 中間體連施例26g 6.8- 二漠咪挫并[1，2-6]化嗦
在室溫下，向包含285 g(1638 mmol)按照中間體實施例2化制備的6-漠化嗦-3-胺、275 g(3276 mmol)NaHC〇3和2815 ml MeOH的混合物中滴加入85 ml(1638 mmol)漠，并在 室溫下攬拌過夜。進一步加入34 ml化55 mmol)漠和55 g化55 mmol) NaHC〇3之后，將該混 合物再次攬拌過夜。將溶劑減少到大約1000ml,并將該混合物傾倒在5升水上。濾出沉 淀，用水洗涂，干燥，得到411g(99%)標題化合物。 iH-NMR(CDCI3) :δ=6. 14 (1H)，9. 92 (2H)卵m。 陽14引 中間體連施倆I 2化 6-漠化嗦-3-胺
在高壓反應蓋中，在11. 7bar下，將250g(l. 05mol)3,6-二漠化嗦的1.2升25%氨 水溶液加熱至l〇〇°C過夜。冷卻后，濾出沉淀，用水洗涂，干燥，得到137g(75%)標題化合 物。 iH-NMR(DMS0-d6) :δ=6. 58 (1H)，6. 69 (2H)，7. 41 (IH)ppm。 陽150] 中間體連施倆I26i N-環丙基-2-甲基-4-(4, 4, 5, 5-四甲基-1,3, 2-二氧雜棚雜環戊燒-2-基）苯甲酯 胺
在23°C，向260g(1. 02mol)按照中間體實施例26j制備的4-漠-N-環丙基-2-甲 基苯甲酯胺的2升二嗯燒溶液中加入390g二-(戊酷）-二棚、19. 5g 2-二環己基麟 基-2'，4'，6' - Ξ異丙基聯苯、150. g乙酸鐘和9. 37 g Ξ-(二亞芐基丙酬）-二鈕（0)，并將 該混合物回流6小時。冷卻至23°C后，加入水和乙酸乙醋，并將該混合物攬拌15分鐘。用 水洗涂有機相，用硫酸鋼干燥，過濾，蒸發。色譜純化殘余物，得到308g巧6%)標題化合物。 1H-NMR(300MHz,CDC!3): δ=0.59 (2H), 0.85 (2H), 1.33 (6H), 2.41 (3H), 2. 87 (IH), 5.94 (IH), 7.28 (IH), 7.60 (IH), 7.63 (IH)ppm。
[0151] 中間體連施倆I26i 4-漠-N-環丙基-2-甲基苯甲酯胺
在23°C，向300g(1.4mol)4-漠-2-甲基苯甲酸的8. 4升二氯甲燒攬拌溶液中加入 79. 6g環丙胺和320. 9g邸C。攬拌過夜之后，用水洗涂該溶液，并將水相用二氯甲燒提取。 用硫酸鋼干燥合并的有機相，過濾，蒸發。將剩余的固體與二異丙酸一起研磨，過濾，洗涂， 真空干燥，得到260g(73%)標題化合物。
[0152] 化合物A27 N-環丙基-4- {6-化3-二氣-4-甲氧基苯氧基）-8- [ (3, 3, 3-Ξ氣丙基）氨基]咪挫 并[l，2-b]化嗦-3-基}-2-甲基苯甲酯胺
將31.9g(199mmol)2,3-二氣-4-甲氧基苯酪的450ml二甲亞諷溶液用7. 96g(199mmol)氨化鋼處理，并在室溫下攬拌1小時。然后，加入16g(33. 2mmol)按照中間體實施 例27a制備的4-{6-漠-8-[化3,3-Ξ氣丙基）氨基]咪挫并[l，2-b]化嗦-3-基}-N-環 丙基-2-甲基苯甲酯胺，并將該混合物在130°C下加熱過夜。冷卻后，加入300ml乙酸乙 醋，并將有機相用水洗涂。蒸發有機相之后，將殘余物與200ml乙醇一起研磨，得到12.05 g(65%)標題化合物。 古-醒R(DMS0-d6): 5 =0.47-0. 53 (2H), 0.62-0. 70 (2H), 2.11 (3H), 2.72 (2H), 2.80(1H), 3.64(2H), 3. 92 (3H), 6.22(1H), 7. 12(1H), 7. 18(1H), 7.27(1H), 7. 63(1H), 7. 72(1H), 7. 75-7. 81 (IH), 7. 97(1H), 8. 24(lH)ppm〇 陽1閲中間體連施例27a 4-{6-漠-8-[化3,3-Ξ氣丙基）氨基]咪挫并[l，2-b]化嗦-3-基}-N-環丙基-2-甲 基苯甲酯胺
將包含127g(292mmol)按照中間體實施例2化制備的6-漠-3-艦代-N-化3, 3-Ξ氣丙基）咪挫并[l，2-b]化嗦-8-胺、95. 93g(438mmol)按照中間體實施例27c制備的 [4-(環丙基氨甲酯基）-3-甲基苯基]棚酸、23.8g(29mmol) (1,1-二（二苯基麟基）二 茂鐵）-二氯鈕（11)、438ml1M碳酸鐘水溶液和973ml四氨巧喃的混合物在80°C下攬拌 8小時，并在60°C下進一步攬拌6天。將乙酸乙醋加入到分離的有機相中，并將該混合物 用水洗涂。用A化0X過濾后，蒸發有機相，并將殘余物與200ml乙醇一起研磨，得到71. 2 g(51%)標題化合物。 古-醒R(DMS0-d6) : δ=0. 48-0. 58 (2H)，0. 63-0. 73 (2H)，2. 38 (3H)，2. 68 (2H)， 2. 83(1Η), 3. 61(2Η), 6. 49(1Η), 7. 40(1Η), 7. 87(1Η), 7. 93(1Η), 7. 96-8. 04 (2Η), 8. 32 (1Η)ppm。 陽154] 中間體連施倆I2化 6-漠-3-艦代-N-化3, 3-Ξ氣丙基）咪挫并[1，2-b]化嗦-8-胺
向119g(295mmol)按照中間體實施例26e制備的6, 8-二漠-3-艦代咪挫并[l，2-b] 化嗦的800mlTHF溶液中加入66.8g巧90. 8mmol) 3, 3,3-Ξ氣丙-1-胺，并將該混合物 在80°C下攬拌2小時，在50°C下攬拌過夜。蒸發該溶液，加入600ml乙酸乙醋，并將該混 合物用水洗涂。將有機相干燥，蒸發，得到127g(99%)標題化合物。 'H-NMR(DMS0-d6) : δ=2. 63 (2Η), 3. 55 (2Η), 6. 43 (1Η), 7. 59 (1Η), 7. 89-7. 98 (1Η) ppm。
[01巧] 中間體連施倆I27c
[4-(環丙基氨甲酯基）-3-甲基苯基]棚酸
在室溫下，向按照中間體實施例26i制備的N-環丙基-2-甲基-4-(4,4, 5, 5-四甲 基-1，3, 2-二氧雜棚雜環戊燒-2-基）苯甲酯胺（20. 2g，67. 13mol)的丙酬（300ml)溶 液中加入高艦酸鋼（43. 1g，201. 40mol)和乙酸錠（134. 26mol, 134ml1M水溶液），并將 該混合物攬拌3小時。加入更多的水（120ml),并將該混合物在40°C下再攬拌2小時。加 入4N肥1(32ml)之后，真空取出有機相，并將剩余物用乙酸乙醋提取。用飽和氯化鋼溶液 洗涂有機相，通過怖atman過濾器過濾，并蒸發。將殘余物再溶解在甲苯中，蒸發（兩次）， 得到14. 59g(94. 3%) [4-(環丙基氨甲酯基）-3-甲基苯基]棚酸。 iH-匪R(300MHz,de-DMSO): 5=8.21(1田，8.04(2H), 7.56(2H), 7.17(1H), 2. 77(1H), 2. 25(3H), 0. 62 (2H), 0. 47(2H)ppm〇[0156]化合物A28 N-環丙基-4- {6-化3-二氣-4-甲氧基苯氧基）-8-[(四氨-2H-化喃-4-基甲基）氨 基]咪挫并[1，2-b]化嗦-3-基}-2-甲基苯甲酯胺
在室溫下，向52mg化1mmol)按照中間體實施例28a制備的N-環丙 基-4- [6-化3-二氣-4-甲氧基苯氧基）-8-(甲橫酷基）咪挫并[1，2-b]化嗦-3-基]-2-甲 基苯甲酯胺的NMP(2ml)溶液中加入1-(四氨-2H-化喃-4-基）甲胺（35mg，0. 3mmol) 和DIPEA(0. 3mmol，51μ1)，并將該混合物在110°C下攬拌72小時，HPLC純化之后，得到 26. 9mg(47%)標題化合物 古-醒R(DMS0-d6) : δ=0. 43-0. 50 (2H)，0. 58-0. 69 (2H)，1. 22 (2H)，1. 62 (2H)， 1. 86-2. 02(1Η), 2. 04-2. 11 (3Η), 2. 77(1Η), 3. 19-3. 30 (4Η), 3. 82(2Η), 3. 89 (3Η), 6. 16(1Η), 7. 03-7. 13(1Η), 7. 15(1Η), 7. 20-7. 30(1Η), 7. 57-7. 63(1Η), 7. 69(1Η), 7. 80(1Η), 7. 93(1Η), 8. 24(lH)ppm〇 陽157]中間體連施例28a N-環丙基-4-[6-化3-二氣-4-甲氧基苯氧基）-8-(甲橫酷基）咪挫并[l，2-b]化 嗦-3-基]-2-甲基苯甲酯胺
類似于中間體實施例26b，使986mg(1986帕〇1)按照中間體實施例28b制備的N-環丙 基-4-[6-化3-二氣-4-甲氧基苯氧基）-8-(甲硫基）咪挫并[l，2-b]化嗦-3-基]-2-甲 基苯甲酯胺轉化，后處理之后，得到1040mg(99%)標題化合物。 iH-NMR(DMS0-d6): 5=0.44-0. 51 (2H), 0.61-0. 69 (2H), 2.11 (3H), 2. 73-2. 84 (1H), 3. 66(3H), 3. 91(3H), 7. 13-7. 7. 23(1H), 7. 33-7. 42(1H), 7. 64-7. 70(3H), 8. 30(1H), 8. 40(lH)ppm〇 陽15引 中間體連施倆I28b N-環丙基-4-[6-化3-二氣-4-甲氧基苯氧基）-8-(甲硫基）咪挫并[l，2-b]化 嗦-3-基]-2-甲基苯甲酯胺
類似于化合物427，使用2,3-二氣-4-甲氧基苯酪，使3.1邑(7428帕〇1)按照中間體 實施例2化制備的4-[6-漠-8-(甲硫基）咪挫并[1，2-b]化嗦-3-基]-N-環丙基-2-甲 基苯甲酯胺轉化，后處理并純化之后，得到1010mg(27%)標題化合物。 古-醒R(DMS0-d6) : δ=0. 44-0. 50 (2H)，0. 59-0. 70 (2H)，2. 09 (3H)，2. 67 (3H)， 2. 73-2. 83 (1Η) , 3. 90 (3Η) , 7.06(1Η), 7.14(1Η), 7.19(1Η), 7.31(1Η), 7. 58-7. 65 (1Η), 7.67 (1Η), 8.09 (1Η), 8.26 (1Η)ppm。
[0159] 增殖試驗 在96孔微滴定板中，將培養的腫瘤細胞（MCF7,激素依賴性人類乳腺癌細胞，ATCC HTB22 ;NCI-H460,人類非小細胞肺癌細胞，ATCCHTB-177;DU145,激素非依賴性人類前列 腺癌細胞，ATCCHTB-81 ;HeLa-MaTu，人類宮頸癌細胞，EPO-GmbH，Berlin;HeLa-MaTu-ADR， 多藥耐受性人類宮頸癌細胞，EPO-GmbH，Berlin出eLa人類子宮頸腫瘤細胞，ATCC(XL-2 ; B16F10小鼠黑素瘤細胞，ATCC邸L-6475)涂覆在200μL它們的相應的生長培養基（添加 !0〇/〇胎牛血清）中，密度為5000個細胞/孔（MCF7,DU145,HeLa-MaTu-ADR)、3000個細胞/ 孔（NCI-H460，HeLa-MaTu，HeLa)或1000個細胞/孔度16F10)。24小時之后，將一個板（零 點板）的細胞用龍膽紫染色（見下文），同時，將其它板的培養基用新的培養基（200μ1) 替代，向其中加入各種濃度（0μM，W及在0.01-30μΜ范圍內；溶劑二甲亞諷的最后濃度是 0.5%)的試驗物質。在試驗物質的存在下，將細胞培養4天。利用龍膽紫染色細胞，測定細 胞增殖：在室溫下，每個測點加入20μ1的11%戊二醒（glutaricaldehyde)溶液，將細胞 固定15分鐘。將固定的細胞用水洗涂Ξ次之后，將板在室溫下干燥。每個測點加入100μ1 的0. 1%龍膽紫溶液（ρΗ3. 0)，將細胞染色。將染色的細胞用水洗涂Ξ次之后，將板在室溫下 干燥。每個測點加入100μ1的10%乙酸溶液，將染料溶解。利用光度法，在595nm的波長 下，測定消光。相對于零點板的消光值（=0%)和未經處理的（0μm)細胞的消光值（=100%)， 將測定值歸一化，計算細胞數量的百分數變化。使用公司自己的軟件，利用4參數擬合法， 測定ICs。值。
[0160]Mps-1激酶試驗 人類激酶Mps-1使生物素化的底物膚憐酸化。利用館標記的抗憐酸絲氨酸/蘇氨酸抗 體（作為供體）至交聯別藻藍蛋白（SA-XLent)標記的鏈親和素（作為受體）的時間分辨 巧光共振能量轉移（TR-FRET)，完成憐酸化產物的檢測。檢驗化合物對激酶活性的抑制。
[016。 使用N-末端GST標記的人類全長重組Mps-1激酶（購買于Invitrogen， Karslruhe，Germany,cat.no:PV4071)。對于激酶反應的底物，使用氨基酸序列PWDP孤AD口EILG(酷胺形式中的C-末端，購買于BiosynthanGmbH，Berlin)的生物素化的 膚。
[0162] 對于該試驗，將50化試驗化合物的100倍濃縮液（在DMS0中）吸到黑色低容 量384孔微孔板（GreinerBio-OneJrickenhausen，Germany)中，加入 2μ1Mps-1的試驗 緩沖液[0. 1ml原饑酸鋼，10mlMgCl2,2mlDTT，25mlHepes，抑7. 7,0. 05%BSA，0.OOP/o PluronicF-127]溶液，并將該混合物在22°C下培養15分鐘，使試驗化合物與Mps-1預先結 合，而后開始激酶反應。然后，加入3μ1 16. 7-腺巧-Ξ憐酸（ATP，16. 7μΜ=>最終濃度，在 5μ1試驗體積中是ΙΟμΜ)和膚底物（1. 67μΜ=>最終濃度，在5μ1試驗體積中是?μΜ)的試驗緩 沖液溶液，開始反應，并將得到的混合物在22°C下培養60分鐘的反應時間。將Mps-1在該試 驗中的濃度調節至酶批量的活性，并進行合適地選擇，使試驗在線性范圍內進行，典型的酶 濃度在大約1nM(在5μ1試驗體積中的最終濃度）范圍之內。加入3μ1HTRF檢測試劑的溶 液（100mlHepes，抑7. 4,0. 1〇/〇BSA，40mlEDTA，140ηΜ鏈親和素-XLent[#61GSTXLB，Fa. CisBiointernational，Ma;rcoule，Rrance]，1.5nM抗憐酸（Ser/T虹）-館-抗體[#AD0180， PerkinElmerLAS，Rod邑au-Ju邑esheim，Germany]，使反應終ih。
[0163] 將得到的混合物在22°C下培養1小時，使憐酸化的膚與抗憐酸（Ser/T虹)-館-抗 體結合。隨后，通過測定館標記的抗憐酸（Ser/T虹）抗體至鏈親和素-XLent的共振能 量轉移，評估憐酸化底物的量。因此，利用ViewluxTR-FRET讀數器（Perki址ImerLAS， Rodgau-化gesheinbGermany)，測定在350皿激發之后的在620皿和665皿的巧光發射。 "空白校正的歸一化比值"(Viewlux特定的讀出數據，與665皿和622皿發射的常規比值 相似，其中，在計算比值之前，從665nm信號中減去空白和Eu-供體串擾）作為憐酸化底 物數量的量度標準。將數據歸一化（沒有抑制劑的酶反應=0%抑制，沒有酶的所有其它試 驗組分=100%抑制）。在相同微孔板上，在2〇μΜ至1ηΜ范圍內的10個不同濃度下（2〇μΜ、 6. 7μΜ、2. 2μΜ、0. 74μΜ、0. 25μΜ、82ηΜ、27ηΜ、9. 2ηΜ、3.InM和InM，在試驗之前，通過系列 1:3 稀釋，用100倍濃儲備溶液制備的稀釋系列）對試驗化合物進行檢驗，各個濃度一式兩份數 值，通過4參數擬合法，使用內部軟件，計算ICw值。
[0164] 紡鍵體組裝檢測點試驗 紡鍵體組裝檢測點保證染色體在有絲分裂期間的合適分離。一旦進入到有絲分裂階 段，染色體開始凝聚，同時伴隨有組蛋白H3在絲氨酸10上的憐酸化。在有絲分裂后期，組 蛋白H3在絲氨酸10上的脫憐酸開始，并在末期早段結束。相應地，組蛋白H3在絲氨酸10 上的憐酸化可W在有絲分裂中用作細胞的標志。嚷氨醋化挫是使微管不穩定的物質。由 此，嚷氨醋化挫妨礙微管動力學，并調動紡鍵體組裝檢測點。細胞在有絲分裂的G2/M躍遷 階段抑制，并且顯示出在絲氨酸10上的憐酸化的組蛋白冊。在嚷氨醋化挫的存在下，通過 Mps-1抑制劑來抑制紡鍵體組裝檢測點，克服了有絲分裂阻抑，并且細胞過早地完成有絲分 裂。通過具有絲氨酸10上的組蛋白冊憐酸化的細胞的減少，檢測運種變化。運種減少用 作測定本發明化合物誘導有絲分裂突破能力的標志。
[016引在384孔微孔板中，將培養的人類子宮頸腫瘤細胞系化La(ATCCC化-。的細胞涂 覆在20μ1Du化eco'S培養基（w/o酪紅，w/o丙酬酸鋼，wlOOOmg/ml葡萄糖，WR比唉醇） (補充有l%(v/v)谷氨酷胺、l%(v/v)青霉素、l%(v/v)鏈霉素和10%(v/v)胎牛血清）中，密 度為2500個細胞/孔。在37°C下培養過夜之后，將10μ1/孔的嚷氨醋化挫（最后濃度為 0. 1μg/ml)加入到細胞中。培養24小時之后，在細胞周期進程的G2/M期，使細胞受到阻抑。 加入各種濃度（0μM，W及在0. 005μM-10μΜ范圍內；溶劑DMS0的最后濃度是0. 5%(v/v)) 的溶解在二甲亞諷（DMS0)中的試驗化合物。在試驗化合物的存在下，將細胞在37°C下培養 4小時。而后，在4°C，將細胞固定在4%(v/v)多聚甲醒/憐酸鹽緩沖鹽水（PBS)中過夜，然 后，在室溫下，在0.l%(v/v)TritonX? 100/PBS中滲透20分鐘，并在室溫下，在0. 5%(v/v) 牛血清白蛋白度SA)/PBS中封閉15分鐘。用PBS洗涂之后，將20μ1/孔的抗體溶液（抗憐 酸組蛋白冊克隆3Η10,門TC;化state,Cat# 16-222 ;1:200稀釋）加入到細胞中，在室溫 下培養2小時。然后，用PBS洗涂細胞，將20μ1/孔的冊EC服Τ 33342染料溶液巧μκ/πι1) 加入到細胞中，并將細胞在室溫下、在暗處培養12分鐘。用PBS洗涂細胞兩次，然后用PBS 覆蓋，并在4°C下保存，直到分析為止。使用化rkin Elmer OPERA?高含量分析讀數器，獲 得圖像。使用圖像分析軟件MetaXpress?(從Molecular devices獲得），使用細胞周期應 用模塊，分析圖像。在該試驗中，測定兩個標記物冊ECHST 33342和絲氨酸10上的憐酸化 的組蛋白冊。冊EC服T 33342標記DNA，并用于統計細胞數量。絲氨酸10上的憐酸化組蛋 白冊的染色，用于測定有絲分裂細胞的數目。在嚷氨醋化挫的存在下，抑制Mps-1，使有絲 分裂細胞數量降低，運表示不合適的有絲分裂進展。利用四參數邏輯回歸分析，進一步分析 原始試驗數據，測定每個試驗化合物的ICs。值。
[0166] 分析在大鼠肝細胞中的體外代謝穩定性（包括肝臟的體內血液清除率（CL)的計 算） 通過2步灌注方法，從HanWistar大鼠中分離出肝細胞。灌注之后，從大鼠中小屯、地 取出肝：打開肝包膜，并將肝細胞輕輕地抖出到含有冰冷的WME的陪氏培養皿中。在50 ml化Icon試管中，將得到的細胞懸液通過消毒紗布過濾，并在室溫下，在50Xg下離屯、3分 鐘。將細胞球粒再懸浮在30mlWME中，并在100Xg下，離屯、通過化rcoir梯度2次。將 肝細胞再次用Williams'培養基E(WM巧洗涂，并再懸浮在含有5%FCS的培養基中。通過 臺吩藍拒染法，測定細胞活力。
[0167] 對于代謝穩定性試驗，將肝細胞分配在玻璃管瓶的含有5%FCS的WME中，密度為 1.0Xl〇6個活細胞/ml。加入試驗化合物，最后濃度為?μΜ。在培養期間，連續地搖動肝細 胞的懸浮液，并在2、8、16、30、45和90分鐘獲取等分試樣，向其中立即加入相同體積的冷甲 醇。將樣品在-2〇°C冷凍過夜，隨后在3000巧m下離屯、15分鐘，并用Agilent1200HPLC 系統（帶有LCMS/MS檢測）分析上清液。
[016引由濃度-時間曲線圖，測定試驗化合物的半衰期。由半衰期來計算內在清除率。W及其它參數：肝血流量、體內和體外肝細胞的數量。計算肝臟的體內血液清除率（CL)和最 大口服生物利用率（FmJ。使用下列參數值：肝血流量-4. 2L/h/kg大鼠；特定肝重量-32 g/kg大鼠體重；體內肝細胞-1. 1X108個細胞/g肝，體外肝細胞-0. 5X10 6個細胞/ml。
[0169] 在人類CYP3A4上測定抑制潛力 在體外試驗中，使用人類肝微粒體和參考底物咪化挫侖，評價試驗化合物充當CYP3A4 的競爭性抑制劑的潛力。將試驗化合物溶解在乙臘中。人類肝微粒體制劑（HLM的池）用 于該試驗。
[0170] 將試驗化合物的儲備溶液加入到含有邸TA、NADP、葡糖-6-