2.4 VSVMP/DPP復合物在體外對SK0V3細胞的抗腫瘤能力
[0116]為了檢測VSVMP/DPP復合物在體外對SK0V3細胞的抗腫瘤能力，我們首先用MTT法檢測VSVMP/DPP復合物是否抑制SK0V3細胞生長，結果見圖9A，可以看出VSVMP/DPP復合物可以明顯抑制腫瘤細胞的生長。當VSVMP/DPP復合物轉染SK0V3細胞48小時后，我們用annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑來檢測VSVMP/DPP復合物是否是通過誘導細胞凋亡從而抑制腫瘤細胞的生長，通過流式細胞術檢測結果，結果見圖9B，可以看出在SK0V3細胞中，VSVMP/DPP實驗組、EP/DPP空載組、DPP納米粒材料組、生理鹽水組誘導凋亡細胞百分比分別是30%、7.28%,6.73%和5.63%,VSVMP/DPP復合物誘導凋亡細胞數明顯高于其他三組(空載組、材料組和生理鹽水組)(P〈0.05)。從體外抗腫瘤活性結果可以看出，DPP納米粒可以有效地將VSVMP基因質粒有效轉染到SK0V3細胞中，通過誘導凋亡從而抑制腫瘤細胞的增殖。
[0117]2.5 VSVMP/DPP復合物在體內對SK0V3細胞的抗腫瘤作用:VSVMP/DPP復合物抑制裸鼠腹腔移植瘤的生長
[0118]在小鼠SK0V3卵巢癌腹腔種植瘤模型中，經腹腔注射進行治療，達到預期實驗期間后，將老鼠處死。我們將小鼠腹腔的腫瘤結節取下，并進行腫瘤稱重，結果見圖10A，實驗組、空載質粒組、材料組、對照組四個組的平均腫瘤重量分別是0.13g、0.50g、l.51g、l.88g，實驗組的平均腫瘤重量明顯低于空載質粒組、材料組和對照組(P〈0.01)。同時收集小鼠腹腔腹水，并測量腹水體積，實驗組、空載質粒組、材料組、對照組四個組的平均腹水體積分別是 1.0±0.05ml、0.89±0.lml、0.6±0.08ml、0.05±0.2ml，實驗組的平均腹水產生體積也低于空載質粒組、材料組和對照組(P〈0.05)，結果見圖10B。
[0119]3.前期篩選試驗:
[0120]3.1.在前期實驗過程中，發明人將mPEG-PLA與D0TAP的重量比定為:99:1，90:10，，85:15，80:20，70:30，60:40制備DOTAP-mPEG-PLA納米粒。然后對這些納米粒進行細胞轉染實驗，發現DOTAP-mPEG-PLA的原料mPEG-PLA共聚物70-99份、D0TAP 1-30份在99:1?70:30的比例范圍內有較好的轉染效率。在此基礎上進一步將mPEG-PLA與D0TAP的比例縮小至95:5?85:15的比例范圍，然后進行細胞轉染實驗發現在此范圍內有更高的轉染效率。
[0121]3.2.在前期納米基因藥物的制備過程中，將基因在基因藥物中的含量定為1%?50%，進行凝膠阻滯分析和細胞轉染實驗發現，在這個比例范圍內基因能夠有效結合DPP納米粒并有較好的轉染效率。
[0122]3.3.在前期的基礎上，進一步將基因含量縮小至1%?10%，再次進行凝膠阻滯分析和細胞轉染實驗發現，在這個比例范圍內基因能夠高效的結合DPP納米粒并有更好的轉染效率。
[0123]3.4.制備納米粒時，考察了溶解mPEG-PLA和D0TAP的溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲燒、乙醇、甲醇、乙醚、戊燒、乙酸乙酯、環己烷等易揮發的溶劑，發現均可使mPEG-PLA和D0TAP完全溶解。
[0124]3.5.用于水化mPEG-PLA和D0TAP混合物的水化溶液可以為雙蒸水、去離子水，純水，生理鹽水等，最終均可得到DPP納米粒溶液。但優選采用雙蒸水為水化溶液。
[0125]3.6.制備DPP納米粒所需的mPEG-PLA共聚物中，mPEG和PLA的分子量比例為1:1，mPEG-PLA的總分子量范圍為4000Da?8000Da。
[0126]綜上，本發明提供了一種新的修飾手段用以修飾mPEG-PLA雙嵌段共聚物，發明人采用帶正電荷的兩親性物質D0TAP修飾兩親性mPEG-PLA雙嵌段共聚物，利用自組裝的方法制備出了一種新型的可降解性基因載體，即DOTAP-mPEG-PLA陽離子納米粒。該納米粒具有良好的DNA結合能力，可有效地將基因質粒導入到腫瘤細胞中，具有轉染率高、細胞毒性低的優點。由DOTAP-mPEG-PLA納米粒制備的DPP/VSVMP復合物可以顯著地減少小鼠腫瘤的負荷和腹水的產生。體外體內治療數據表明，DPP納米粒傳遞VSVMP基因可以在體外和體內有效抑制人卵巢癌腫瘤細胞SK0V3的生長。在體外和體內有效抑制人卵巢癌細胞的生長。DPP納米粒是一種相對安全的可降解性非病毒基因載體，制備所得VSVMP/DPP復合物為治療卵巢癌提供了一種新的思路和潛在的選擇。
【主權項】
1.DOTAP-mPEG-PLA納米粒溶液的制備方法，其特征在于:按照下述配比關系取原料、溶劑進行制備: 原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質量比為:mPEG_PLA共聚物70-99份、D0TAP1-30份； 溶劑:二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、環己烷中的至少一種； 水化溶液:雙蒸水、去離子水、純水、生理鹽水； 制備方法:將mPEG-PLA共聚物、D0TAP分別溶于溶劑中，然后將溶劑蒸發，加適量水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即為DPP納米粒溶液。2.根據權利要求1所述的DOTAP-mPEG-PLA納米粒溶液的制備方法，其特征在于:所述原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質量比為:mPEG_PLA共聚物85-95份、D0TAP 5-15份。3.權利要求1或2所述的制備方法所得的DOTAP-mPEG-PLA納米粒溶液。4.DOTAP-mPEG-PLA納米粒，由權利要求3所述的DOTAP-mPEG-PLA納米粒溶液干燥即得DOTAP-mPEG-PLA 納米粒。5.DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物，其特征在于:權利要求4所述的DOTAP-mPEG-PLA納米粒負載基因、化學藥物、蛋白質和疫苗，得到DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物。6.根據權利要求5所述的DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物，其特征在于:所述基因為編碼水泡口炎病毒基質蛋白的質粒。7.權利要求5或6所述的DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物的制備方法，其特征在于: 采用DOTAP-mPEG-PLA納米粒負載VSVMP得到VSVMP/DPP復合物，所述VSVMP/DPP復合物，包括下述配比關系的原料及輔料:原料:DOTAP-mPEG-PLA納米粒與VSVMP質量比為:DOTAP-mPEG-PLA納米粒1_99份，VSVMP 1份；滲透壓調節劑適量； 溶劑:注射用水、雙蒸水、去離子水、純水、生理鹽水； 制備方法如下: 將上述原料及溶劑按照滲透壓調節劑、溶劑、DOTAP-mPEG-PLA納米粒和VSVMP依次混合即得VSVMP/DPP復合物溶液，所得溶液達到生理滲透壓。8.根據權利要求7所述的DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物的制備方法，其特征在于:所述原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質量比為DOTAP-mPEG-PLA納米粒90-99份，VSVMP1-10 份。9.權利要求5或6所述DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物在制備治療卵巢癌的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明屬于醫藥領域，具體涉及DOTAP-mPEG-PLA納米粒及其納米粒溶液、載藥復合物和制備方法和應用。本發明所解決的技術問題是提供一種采用DOTAP修飾兩親性mPEG-PLA雙嵌段共聚物，利用自組裝的方法制備出了一種新型的可降解性基因載體，即DOTAP-mPEG-PLA陽離子納米粒，可簡稱為DPP納米粒。本發明DPP納米粒具有良好的DNA結合能力，可有效地將基因質粒導入到腫瘤細胞中，具有轉染率高、細胞毒性低等優點。
【IPC分類】A61K48/00, A61K47/34, A61K9/51, A61P35/00
【公開號】CN105362251
【申請號】CN201510925693
【發明人】茍馬玲, 魏于全, 門可
【申請人】四川大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月14日