DOTAP-mPEG-PLA納米粒及其納米粒溶液、載藥復合物和制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，具體涉及DOTAP-mPEG-PLA納米粒及其納米粒溶液、載藥復合物和制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]基因導入系統在基因功能研究和基因治療中有重要應用。目前使用的基因導入系統主要包括兩大類:病毒載體和非病毒載體。病毒載體包括逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺病毒相關載體，可高效地將治療基因傳遞到細胞內，但其規模生產難度大，可遞送的基因容量小，易引起免疫反應，有潛在的生物安全風險。非病毒基因載體包括脂質體、陽離子納米粒、無機納米粒子載體等，具有免疫原性低，安全性較好，易大規模生產等特點，是當前基因導入系統研究的熱點。
[0003]甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methoxypoly (ethylene glycol)-poly (lactide)，簡稱mPEG-PLA)雙嵌段聚合物是一種可降解、生物相容性好的兩親性聚合物，在生物醫學領域有重要的應用。在20世紀90年代，含有PEG或PLA傳輸載體裝載的藥物已獲得了美國FDA的批準應用于臨床。mPEG-PLA共聚物含有親水嵌段PEG和疏水嵌段PLA，可在水溶液中自組裝成納米顆粒，在藥物、基因導入系統中有很好的應用前景。目前，mPEG-PLA雙嵌段聚合物納米粒載體包裹的紫杉醇制劑已在韓國和歐洲應用于乳腺癌的臨床治療，在美國也已進入II期臨床試驗。在將PEG-PLA納米粒用于基因導入系統時，單純采用mPEG-PLA納米粒裝載基因的難度大，且轉染效率低。進一步對mPEG-PLA納米粒進行物理或化學修飾，可制備出具有易裝載基因、轉染效率高、毒性低、可降解的新型納米粒，在基因導入中有重要的應用，在基因功能研究、基因治療研究及臨床應用中有很好的應用前景。
【發明內容】
[0004]本發明所解決的技術問題是提供一種新的修飾手段用以修飾mPEG-PLA雙嵌段共聚物，發明人采用D0TAP修飾兩親性mPEG-PLA雙嵌段共聚物，利用自組裝的方法制備得到新型的可降解性基因載體，即DOTAP-mPEG-PLA陽離子納米粒，可簡稱為DPP納米粒。本發明DPP納米粒具有良好的DNA結合能力，可有效地將基因質粒導入到腫瘤細胞中，具有轉染率高、細胞毒性低等優點。
[0005]本發明中所采用的兩親性陽離子物質D0TAP，化學命名為(2，3_二油氧基丙基)三甲基氯化銨，簡稱D0TAP。
[0006]本發明中所采用的兩親性mPEG-PLA共聚物，甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，簡稱mPEG-PLA。甲氧基聚乙二醇-聚乳酸納米顆粒具有兩親性、良好的生物可降解性和生物相容性、避免了吞噬細胞吞■、增加了藥物在血液中的循環時間和生物利用度，持續釋放和靶向傳遞從而增加了藥效、減小了副作用。mPEG-PLA納米粒不僅可以作為化學藥物、蛋白質和疫苗等的載體，同時也可以作為基因藥物的載體。
[0007]本發明利用自組裝的方法制備DOTAP-mPEG-PLA納米粒，按照下述配比關系取原料、溶劑進行制備:
[0008]原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質量比為:mPEG_PLA共聚物70-99份、D0TAP1-30 份；
[0009]溶劑:二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、環己烷等易揮發的溶劑中的至少一種；
[0010]水化溶液:雙蒸水、去離子水、純水、生理鹽水；
[0011]制備方法:mPEG-PLA共聚物、D0TAP分別溶于溶劑中，然后將溶劑蒸發，加適量水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即為DPP納米粒溶液。
[0012]將所述透明液體干燥即得DOTAP-mPEG-PLA納米粒。
[0013]進一步優選的，本發明DPP納米粒，按照下述配比關系取原料進行制備:
[0014]原料:mPEG-PLA共聚物與D0TAP的質量比為:mPEG_PLA共聚物85-95份、D0TAP5-15 份。
[0015]上述技術方案中，溶劑用量以能夠溶解原料即可。
[0016]本發明DOTAP-mPEG-PLA納米粒的平均粒徑為73±6nm，平均電位為+46±2mV，具備良好的DNA結合能力。與金標轉染材料PEI 25K相比，本發明DPP納米粒具有更高的轉染能力和較低的細胞毒性。
[0017]本發明DOTAP-mPEG-PLA納米粒可用于負載活性成分，尤其是基因、化學藥物、蛋白質和疫苗，得到DOTAP-mPEG-PLA納米粒復合物。
[0018]DOTAP-mPEG-PLA納米粒屬生物可降解性陽離子納米粒，是一種新型基因導入系統非病毒載體。該納米粒能通過靜電相互作用結合DNA，可以有效地將目的基因或化學藥物、蛋白質和疫苗等活性成分導入腫瘤細胞中，其本身具有細胞毒性低、轉染率高等特征。
[0019]如，可以采用DOTAP-mPEG-PLA納米粒傳遞水泡口炎病毒基質蛋白(VSVMP)基因質粒，即采用DOTAP-mPEG-PLA納米粒負載VSVMP得到VSVMP/DPP復合物。
[0020]本發明VSVMP/DPP復合物，包括下述配比關系的原料及輔料:
[0021 ]原料:DOTAP-mPEG-PLA 納米粒與 VSVMP 質量比為:DOTAP-mPEG-PLA 納米粒 1_99份，VSVMP 1 份；
[0022]滲透壓調節劑適量，用量以配制所得VSVMP/DPP復合物達到生理滲透壓即可；
[0023]溶劑:注射用水、雙蒸水、去離子水、純水或生理鹽水；
[0024]制備方法如下:
[0025]將上述原料及溶劑按照滲透壓調節劑、溶劑、DOTAP-mPEG-PLA納米粒和VSVMP依次混合即得VSVMP/DPP復合物溶液，所得溶液達到生理滲透壓。
[0026]進一步優化，本發明VSVMP/DPP復合物按照下述配比關系取原料進行制備:
[0027]所述VSVMP/DPP復合物，包括下述配比關系的原料及輔料:原料:DOTAP-mPEG-PLA納米粒與VSVMP質量比為DOTAP-mPEG-PLA納米粒90-99份，VSVMP 1-10份。
[0028]發明人發現利用DOTAP-mPEG-PLA納米粒傳遞VSVMP基因質粒可應用于體外和體內治療卵巢癌:
[0029]在體外，發明人用MTT法檢測VSVMP/DPP復合物對SK0V3卵巢癌細胞生長的抑制作用，并用流式細胞術檢測VSVMP/DPP復合物誘導細胞凋亡情況。發明人發現利用DPP納米粒介導VSVMP基因質粒進入SK0V3卵巢癌細胞中，DPP/VSVMP復合物通過誘導凋亡可以明顯抑制SK0V3細胞的生長。
[0030]在體內，發明人建立人卵巢癌裸鼠腹腔種植瘤模型，比較各組裸鼠腹腔腫瘤結節的重量和數目，以及腹水產生的差異。發明人發現DPP/VSVMP復合物可以顯著地減少小鼠腫瘤的負荷和腹水的產生。體外體內治療數據表明，DPP納米粒傳遞VSVMP基因可以在體外和體內有效抑制人卵巢癌腫瘤細胞SK0V3的生長。
[0031]本發明通過自組裝法制備出了一種新型的可降解陽離子納米粒:DOTAP-mPEG-PLA,該納米粒可通過靜電相互作用結合DNA，可有效地將基因導入到腫瘤細胞中，具有基因轉染率高、細胞毒性低等特點，在基因導入中有重要的應用，在基因功能研究、基因治療研究及臨床應用中有很好的應用前景。DOTAP-mPEG-PLA納米粒可介導基因等活性成分發揮療效，如DOTAP-mPEG-PLA納米粒介導VSVMP基因可以在體外和體內有效抑制人卵巢癌細胞的生長。DPP納米粒是一種相對安全的可降解性非病毒基因載體，制備所得VSVMP/DPP復合物為治療卵巢癌提供了一種新的思路和潛在的選擇。
【附圖說明】
[0032]圖1 (A) mPEG-PLA的分子結構式；(B) D0TAP的分子結構式。
[0033]圖2 DPP納米粒的結構示意圖。
[0034]圖3 DPP納米粒的粒徑及電位分布圖:(A) DPP納米粒的粒徑分布圖；(B) DPP納米粒的電位分布圖。
[0035]圖4 DPP納米粒